Insulinproduktionstechnologie

  • Analysen

Insulin ist eines der Hormone, die der menschliche Körper selbst produziert, insbesondere die Bauchspeicheldrüse. Die Verletzung der Sekretion dieser Substanz führt zur Entstehung einer so schweren Erkrankung wie Diabetes. Für seine Behandlung mit einem synthetischen Hormon, das lange Zeit aus dem Pankreas von Tieren isoliert wurde. Die Technologie zur Herstellung von Insulin mit Hilfe eines sehr verbreiteten Bakteriums - Escherichia coli oder Hefepilz - wird jedoch seit geraumer Zeit eingesetzt. Mit dieser Methode können Sie allergische Reaktionen vermeiden, die durch Fremdprotein hervorgerufen werden. Dies unterscheidet sich geringfügig vom Menschen.

Technologisches Schema

Die Produktionstechnologie von Insulin umfasst alle Hauptschritte der Herstellung von Biotech-Produkten. Das Ergebnis ist ein kristallines Endprodukt, das dann zur Herstellung von Injektionslösungen verwendet wird, die zur Behandlung von schwerem Diabetes mellitus Typ I und II verwendet werden. Die Hauptwirkung dieses Hormons im Körper äußert sich in einer Abnahme des Blutzuckerspiegels.

Die Stufen der Insulinproduktion sind wie folgt:

  • Vorläufig Sie führt solche Vorgänge aus, wie die Aufbereitung und Reinigung von Wasser und Luft, die Reinigung von Industrieanlagen und die Sterilisation von Ausrüstung, die Überprüfung von Personal, die Verarbeitung von Händen und die Ausgabe von sterilen Schuhen und Kleidungsstücken. Ebenfalls im Vorstadium wird die primäre chemische Synthese der Molekülketten durchgeführt, aus denen das Protein aufgebaut ist. Kette A enthält 21 Aminosäurereste und Kette B enthält 30 Aminosäuren.
  • Zubereitung von Nährlösungen und Zellkultur. Damit eine lebende Zelle die notwendige Verbindung herstellen kann, wird das entsprechende Gen eingeführt. Dazu wird das Plasmid von speziellen Enzymen, Restriktionen, geschnitten und die Gene, die für die Synthese der notwendigen Verbindungen kodieren, darin eingenäht. Dann wird das modifizierte Plasmid unter Verwendung einer Mikroinjektionsmethode in die Zelle zurückgegeben.
  • Kultivierung der Zellsuspension. Gentechnisch veränderte Zellen werden in eine Nährlösung gegeben, die alle für das Wachstum und die Fortpflanzung notwendigen Bestandteile enthält und sterilisiert wird. Die Kultivierung der Kultur erfolgt in speziellen Bioreaktoren, in die die vorgereinigte Luft eingespeist wird. In regelmäßigen Abständen wird eine bestimmte Menge Nährlösung in den Reaktor gegeben und gleichzeitig das gleiche Volumen der Zellsuspension entnommen.
  • Die Zuteilung von Kultur. Die Trennung von Flüssigkeit und Zellkultur erfolgt durch Sedimentation (Sedimentation) in speziellen Sedimentatoren und anschließender Filtration, wodurch die Integrität der Zellen erhalten werden kann.
  • Chromatographische Reinigung der Substanz. Es wird auf der geeigneten Ausrüstung unter Verwendung verschiedener Verfahren durchgeführt, insbesondere der Frontal-, Anionenaustausch- und Gelpermeationschromatographie.
  • Proteinmolekül bekommen. Im eigentlichen Biotech-Stadium erfolgt die Synthese eines nicht produzierten Insulinmoleküls. Und die zwei Komponenten seiner Ketten. Sie werden nach Oxidation und Faltung der erhaltenen Ketten zusammengenäht, wodurch sich Disulfidbrücken bilden.
  • Gefriertrocknung in einem speziellen Ofen, wonach die resultierende kristalline Zubereitung auf Übereinstimmung mit dem Standard geprüft, verpackt, etikettiert und an den Verbraucher versandt wird.

Unser Unternehmen bietet zu günstigen Bedingungen fertige Produktionslinien an, bei denen die gesamte Technologie der Insulinproduktion vollständig eingehalten wird. Dank präziser Berechnungen, technischer Unterstützung und Informationsunterstützung sowie einer Schulung des Personals im Rahmen eines umfassenden Programms ist das Unternehmen profitabel und die Produkte sind gefragt.

Insulinentdeckung

Heute sind mehr als 400 Millionen Menschen auf der Erde von Diabetes betroffen, das sind etwa 8% der erwachsenen Bevölkerung der Welt. Laut dem staatlichen Register leiden in Russland mehr als 3,3 Millionen Menschen an Diabetes (etwa 300.000 Menschen leiden an Typ-1-Diabetes und etwa 3 Millionen Menschen leiden an Typ-2-Diabetes). Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass diese Zahlen die tatsächliche Situation widerspiegeln. Alle diese Menschen, die jeden Tag leben, wissen, dass ihr Leben von Insulin abhängt.

Die ersten Versuche, Diabetes zu heilen, wurden vor unserer Ära gemacht. Für diese Massage wurden altgriechische und römische Ärzte, Gymnastik, Bäder, Aromatherapie und vieles mehr verwendet. Im 19. Jahrhundert wurde für Diabetiker eine kohlenhydratarme Fleischdiät entwickelt. Der erste Versuch, Diabetes mit Insulinspritzen zu behandeln, wurde 1921 unternommen. Der kanadische Wissenschaftler Frederick Banting war der erste, der Insulinhormon zur Bekämpfung von Diabetes einsetzte. Er war erst 32 Jahre alt, als er den Nobelpreis für Medizin erhielt. Er schuf das Medikament effektiv und reduzierte den Glukosespiegel ohne Nebenwirkungen von 28,9 auf 6,7 mmol / l. Diese Droge gab vielen Menschen Hoffnung auf Leben.

1869 entdeckte der Wissenschaftler Paul Langergans Zellgruppen im Pankreas, die später nach ihm "Inseln der Langerhans" benannt wurden. Anschließend wurde Insulin aus den Zellen dieser Inseln isoliert. Insulin ist ein Hormon, das den Stoffwechsel vor allem von Kohlenhydraten (Zuckern), aber auch von Fetten und Proteinen reguliert. Bei Diabetes aufgrund unzureichender Insulinexposition tritt eine komplexe Stoffwechselstörung auf, der Blutzuckerspiegel steigt an (Hyperglykämie), Zucker wird im Urin ausgeschieden (Glykosurie) und saure Produkte mit Fettverbrennung treten in den Blutkörperchen (Ketoazidose) auf.

Nach der Entdeckung des Insulins begannen viele Wissenschaftler, Methoden zur Reinigung dieses Medikaments zu entwickeln, da Unreinheiten einen geschwächten Körper beeinträchtigen.

Agilent Technologies ist der weltweit führende Anbieter von Analysegeräten. Geräte für die Chromatographie und Spektralanalyse von mehr als einem Jahr haben Wissenschaftlern auf der ganzen Welt geholfen, die lebenswichtigen Probleme von Arzneimitteln zu lösen. Die Kontrolle der Insulinreinheit ist keine Ausnahme. Zuvor wurde für diese Zwecke die klassische Flüssigkeitschromatographie verwendet, wobei durchaus akzeptable Ergebnisse erzielt wurden:

Nach vielen Forschungen haben Wissenschaftler nachgewiesen, dass das gebildete Insulin-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 mit den neuesten Entwicklungen auf dem Gebiet der Ausschlusschromatographie effektiv identifiziert werden kann.

Mit dieser neuen Methode kann man "gutes Insulin", das unter empfohlenen Bedingungen gelagert wurde, und "schlechtes Insulin" vergleichen. Wenn zwei Chromatogramme einander überlagert wurden, stellte sich heraus, dass in der Insulinpräparation, die unter ungünstigen Bedingungen gelagert wurde, das Zielmolekül zerstört wurde und stattdessen Zersetzungsprodukte im Chromatogramm identifiziert wurden.

Entwicklung und Vereinheitlichung von Methoden zur Analyse und Standardisierung von Insulinpräparaten mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

Diese Dissertation soll in naher Zukunft in die Bibliothek gehen.
Benachrichtigen Sie über die Zulassung

Die These - 480 Rubel., Lieferung 10 Minuten, rund um die Uhr, sieben Tage die Woche und an Feiertagen.

Abstract - 240 Rubel, Lieferung 1-3 Stunden, von 10-19 (Moskauer Zeit), außer Sonntag

Pihtar Anatoly Wassiljewitsch. Entwicklung und Vereinheitlichung von Methoden zur Analyse und Standardisierung von Insulinpräparaten mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC): Dissertation. Kandidat der pharmazeutischen Wissenschaften: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Ort des Schutzes: Medizinische Akademie in Moskau "].- Moskau, 2005.- 139 Seiten: Il.

Inhalt für die Dissertation

KAPITEL 1. Literaturübersicht 11

1. Die Rolle von Insulin bei der Behandlung von Diabetes mellitus 11

2. Biosynthese und biologische Wirkung von Insulin 12

3. Allgemeine Merkmale der physikochemischen und pharmazeutischen Eigenschaften von Insulin 15

4. Insulinpräparate 24

5. Produktionsmethoden, Standardisierung und Qualitätskontrolle von Insulinpräparaten 31

6. Die Verwendung von HPLC in der pharmazeutischen Analyse von Insulin. 46

KAPITEL 2. Problemstellung 50

KAPITEL 3. Untersuchung des Einflusses verschiedener Faktoren auf das chromatographische Verhalten von Insulin unter den Bedingungen der RP-HPLC 56

1. Methoden und Materialien 57

2. Diskussion der Ergebnisse 62

2.1. Der Einfluss der Zusammensetzung der Pufferlösung 62

2.2. Die Wirkung der Natriumsulfatkonzentration 68

2.3. Einfluss der chromatographischen Säulentemperatur 70

2.4. Wirkung des organischen Modifizierungsmittels 75

2,5. Der Einfluss der Länge des Alkylradikals der gepfropften Phase 80

2.6. Der Einfluss der Länge der Chromatographiesäule 80

KAPITEL 4. Verbesserung der pharmakopoetischen Methoden zur Analyse von Insulinpräparaten basierend auf der Verwendung von RP-HPLC 82

1. Auswahl der optimalen Bedingungen für die chromatographische Bestimmung von Insulin und seiner Verunreinigungen in Arzneimittelzubereitungen 82

2. Metrologische Merkmale der Methode 84

3. Anwendung der entwickelten Methodik zum Testen der offiziellen Insulinpräparate 95

KAPITEL 5. Entwicklung von Methoden zur Analyse injizierbarer Darreichungsformen von Isophaninsulin basierend auf der PF-HPLC-Methode 107

1. Wahl der Bedingungen für die chromatographische Bestimmung von Protamin in den Darreichungsformen von Isophan-Insulin 110

2. Untersuchung der chromatographischen Profile von Protaminen, die aus verschiedenen Fischarten isoliert wurden 121

3. Verfahren zur Bestimmung von Protamin in Isophan-Insulin-Präparaten 123

4. Validierung der entwickelten Methodik 125

Allgemeine Schlussfolgerungen 136

Referenzen 139

Allgemeine Eigenschaften der physikochemischen und pharmazeutischen Eigenschaften von Insulin

Aus chemischer Sicht ist Insulin ein kleines globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von bis zu 6000 Da. Gleichzeitig ist zu beachten, dass Insulin eine gebräuchliche Bezeichnung für eine ganze Familie von homologen Proteinen natürlichen und künstlichen Ursprungs mit einer gemeinsamen charakteristischen biologischen Aktivität ist. Die Proteinnatur des Insulins wurde 1928 festgestellt [52]. Es ist eines der Proteine, die die Biuret-Reaktion und die Pauli-Reaktion hervorrufen. Die Struktur von Insulin war Anfang der 50er Jahre vollständig etabliert. Die elementare chemische Zusammensetzung von Insulinen verschiedener Herkunft wird durch die in Tabelle 1 angegebenen Zahlen charakterisiert [40].

Aminosäurezusammensetzung. Die meisten Insulinmoleküle enthalten 51 Aminosäurereste, darunter 17 Aminosäuren, die in den meisten bekannten Proteinen vorkommen.

Ein charakteristisches Merkmal der Aminosäurezusammensetzung von Rinder-, Schweine- und Humaninsulin ist Tryptophan und Methionin. Die Aminosäurezusammensetzung dieser Insulintypen ist in Tabelle 2 dargestellt [40, 46].

Invariant für alle Insulintypen ist der Cystingehalt (6 Halbcystinreste). Darüber hinaus enthält das Insulinmolekül aller Arten 6 Amidgruppen (Asparagin, Glutamin).

Wenn Insulin zusammen mit der Hauptfraktion freigesetzt wird, können Fraktionen desamidierter Formen von Insulin beobachtet werden. Im sauren Milieu können im Verlauf der Desamidierung alle 6 Amidgruppen allmählich abgespalten werden und die elektrophoretische und chromatographische Mobilität von Insulin ändert sich [40]. Die Bildung desamidierter Insulinformen kann anhand der Ergebnisse der Ammoniakbestimmung beurteilt werden. Für die vollständige Amidform von Insulin werden 6 Mol Ammoniak pro 1 Mol Protein bestimmt, bei desamidierten Formen kann dieser Wert zwischen 5 und 0 liegen.

Die Primärstruktur von Insulin. Die primäre Struktur des Insulins wurde 1945-1955 von der Sanger-Gruppe entschlüsselt. Mit einer Reihe chromatographischer Methoden, die es ermöglichten, verschiedene Peptide, Aminosäuren und deren Derivate zu trennen und zu identifizieren, gelang es Sanger, die Primärstruktur des Rinderinsulins festzulegen [130,131,132,133,134,135]. Weitere Untersuchungen an Insulinen verschiedener Herkunft mit verschiedenen physikochemischen Methoden, einschließlich der Edman-Methode zur Bestimmung der vollen Aminosäuresequenz in langen Peptiden, bestätigten die Ergebnisse von Sanger und seinen Co-Autoren zur Struktur von Insulin [bb].

Bis heute wurde die Primärstruktur von Insulin in Vertretern von 24 Tierarten bestimmt, die zu 4 Tierklassen gehören: Säugetiere, Vögel, Fische und Zyklostome [14]. Die Forschung zu Insulin verschiedener Herkunft wird fortgesetzt [71,72,73].

Die Struktur von Insulin bei verschiedenen Tieren ist ähnlich, jedoch nicht identisch. In seiner Primärstruktur ähnelt Humaninsulin Schweine-, Hund-, Pottwal- und Kanincheninsulinen und unterscheidet sich nur in einer Aminosäure [40]. Es unterscheidet sich von Rinderinsulin durch drei Aminosäuren. In hohem Maße ähnelt Humaninsulin dem Insulin des guineischen Schweins, der Vögel und der Fische nicht [40]. Unterschiede in der Aminosäuresequenz von Insulinen von Menschen, Schweinen und Rindern sind in Tabelle 3 gezeigt.

Trotz struktureller Unterschiede weisen alle Insulintypen eine ähnliche biologische Aktivität auf, d. H. hypoglykämische Wirkung verursachen. Die Größe der angezeigten biologischen Aktivität hängt jedoch stark von der Spezies ab und liegt im Bereich von 11 IE / mg (cod Insulin aus der Nordsee) bis 62 IE / mg (Truthahn- und Hühnerinsulin), während die Aktivität von Humaninsulin etwa 25 bis 30 IE beträgt / mg [40]. Je größer die Unterschiede zwischen den Spezies sind, desto größer ist der Unterschied in der biologischen Aktivität des entsprechenden Insulins.

Ein funktionell aktives Insulinmolekül besteht aus zwei durch Disulfidbindungen verknüpften Polypeptidketten (A- und B-Ketten); Eine Bindung wird von den siebten Aminosäureresten beider Ketten gebildet, die zweite Disulfidbindung wird vom 20. Rest der A-Kette und vom 19. Rest der B-Kette gebildet (Abbildung 2). Darüber hinaus gibt es im Insulinmolekül eine dritte Disulfidbindung, die intrachain ist und die 6. und 11. A-Kettenreste verbindet [59, 117].

Sekundärstruktur Anhand verschiedener physikalisch-chemischer und physikalischer Forschungsmethoden konnte gezeigt werden, dass das Insulinmolekül eine hochgeordnete räumliche Struktur (Konformation) aufweist, die zur Implementierung spezifischer biologischer Funktionen beiträgt [14]. Im nativen Insulinmolekül liegen sowohl cc-Helix- als auch p-fach-Blätter gleichzeitig vor. Darüber hinaus gibt es Bereiche mit ungeordneter Struktur und Struktur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Wenn eine saure Insulinlösung (pH 2,3-2,5) auf eine Temperatur von +100 ° C erhitzt und schnell auf -80 ° C abgekühlt wird, bildet sich so genanntes fibrilläres Insulin - eine völlig inaktive Form des Hormons [27]. Die Einführung von fibrillären Insulinfasern in eine Lösung von aktivem Insulin bewirkt eine spontane quantitative Ausfällung von Insulin in Form von Fibrillen [14,17].

Produktionsmethoden, Standardisierung und Qualitätskontrolle von Insulinpräparaten

Tierinsulinarten erhalten. Die industrielle Produktion von Insulin aus Rind- und Schweinefleisch wurde fast gleichzeitig in einigen Ländern eingeführt, kurz nach der Entdeckung von Insulin im Jahr 1921 [63]. Seitdem ist das Konzept der Insulingewinnung praktisch unverändert geblieben (Tabelle b) [17, 18]. Die Rohstoffe für die Produktion von Tierinsulinarten sind die Bauchspeicheldrüsen von Schlachtvieh, die für die Ernährung verwendet werden.

Die wichtigste Aufgabe bei der Produktion von Insulin ist die Reinigung - die Freisetzung von Substanzen aus verwandten Verunreinigungen, die die biologische Aktivität verringern, immunologische Reaktionen verursachen oder möglicherweise die Gesundheit des Patienten gefährden. Beispielsweise kann nach mehreren Jahren der Verwendung von schlecht gereinigtem Insulin im Blut des Patienten bis zu 5.000 IE Insulin an Antikörper gebunden sein. Antikörper gegen Insulin beeinflussen das Wirkungsprofil signifikant und tragen so zum labilen Verlauf von Diabetes bei.

Das erste Verfahren zur Reinigung von Insulin war die Umkristallisation in Gegenwart von Zinksalzen. 1945 konnte gezeigt werden, dass die siebenfache Rekristallisation von Insulin die allergischen Reaktionen der Patienten im Vergleich zu den damaligen Insulinpräparaten signifikant reduziert [63].

Die Heterogenität von Insulinproben nach Kristallisation und einfacher Umkristallisation wird anhand verschiedener Methoden gezeigt: Gegenstromextraktion (PE), Verteilungschromatographie (PX), Ionenaustauschchromatographie (IOC), Diskelektrophorese (DEP) und Gelausschlusschromatographie (GEC) [63].

Es wurde festgestellt, dass die hauptsächlichen begleitenden Insulinverunreinigungen sind: Proinsulin, seine Zwischenprodukte, kovalentes Insulindimer, Monodiamidoinsulin, Monoarginin und Monoethylen sowie eine Reihe hochmolekularer Verbindungen von Nicht-Insulin-Natur. Eine verallgemeinerte Schlussfolgerung aus den Ergebnissen der Studien, unter Berücksichtigung der Informationen über die immunologische Aktivität der detektierten Verunreinigungen [138], war die Schlussfolgerung, dass eine zusätzliche Reinigung von Insulinsubstanzen erforderlich ist, sodass bei der Analyse mit DEF- und GEC-Methoden eine Komponente gefunden wurde - das entsprechende Insulin.

Um das Problem der Insulinreinigung im Jahr 1950 zu lösen, wurde die HEC-Methode und 1970 die Anionenaustauschchromatographie (AOX) -Methode vorgeschlagen. Es wurde festgestellt, dass Insulin, das nach der AOX-Methode gereinigt wurde, etwa 500 ppm (parts per million) Verunreinigungen mit Proinsulinaktivität enthält [137]. Eine zusätzliche Reinigung des Insulins mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie an Reversed Phase (RP-HPLC) reduziert den Gehalt an immunogenen Fraktionen bis zur Nachweisgrenze [63].

Eine Übersicht über die aktuellen Entwicklungen auf dem Gebiet der chromatographischen Reinigung von Insulin ist in [96] dargestellt. Sequentiell mit IOC und GEC gereinigtes Insulin wird als Monokomponenten-Insulin bezeichnet [63]. Menschliches Insulin bekommen. Die Suche nach Methoden zur Gewinnung von Humaninsulin erfolgte unter zwei Umständen. Zum einen bot die Dringlichkeit des Rohstoffproblems bei der Produktion von tierischem Insulin zum anderen die rasche Entwicklung der Wissenschaft in diesem Bereich eine echte Gelegenheit, die Idee zum Leben zu erwecken. 1979 und 1981 fast gleichzeitig wurden zwei Methoden zur Gewinnung von Humaninsulin entwickelt - biosynthetisch und halbsynthetisch [102,108]. Im Jahr 1981 begann die Firma Novo Nordisk zum ersten Mal in der Welt mit der Serienproduktion von halbsynthetischem Humaninsulin. Die Methode des Unternehmens basiert auf dem enzymatischen und chemischen Austausch von Al im Schweineinsulinmolekül durch den Rest von Tre [61]. Diese Methode hängt direkt von der Gewinnung der erforderlichen Schweineinsulinmenge ab, wodurch der wirtschaftliche Wert verringert wird. Die Möglichkeit der Gewinnung von Humaninsulin durch die Biosynthesemethode ergab sich aus der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie [10]. Die Arbeiten zur gentechnisch hergestellten Insulinproduktion begannen vor etwa 25 Jahren. Im Jahr 1978 wurde berichtet, dass ein E. coli-Stamm produziert wurde, der die Rattenproduktion produzierte. 1979 konnten Genentechs Studien die Gene, die für Aminosäuresequenzen kodieren, in E. coli klonieren. Insulinketten A und B, die in der p-Halo-Tacidase-Region des Plasmids pBR322 enthalten sind [10,102]. 1981 wurde ein Proinsulin-Genanalogon von Mini-C-Proinsulin synthetisiert, bei dem das 35-gliedrige C-Peptid durch ein Segment von sechs Aminosäuren ersetzt wurde: arg-arg-gly-ser-lys-arg und seine Expression in E. coli. Im Jahr 1982 begann das Unternehmen Eli Lilly mit der in Zusammenarbeit mit Genentech entwickelten Zweikettentechnologie die weltweit erste industrielle Insulinsynthese von Humaninsulin [102]. Derzeit wurde die Möglichkeit der Gewinnung von Humaninsulin mit Hilfe verschiedener Expressionssysteme gezeigt [3,10,101,102]. Aus ökonomischer Sicht ist die Verwendung von genetisch modifizierten Stämmen von grampositiven E. coli-Bakterien, von denen viele als Überproduzenten gelten, von besonderem Interesse [3]. Gleichzeitig wurden mit Saccharomices cerevisiae-Hefezellen signifikante Fortschritte erzielt [3,75]. In Tabelle 7 sind die wichtigsten, für verschiedene Verfahren zur Herstellung rekombinanten Humaninsulins üblichen Stadien des technologischen Prozesses aufgeführt [3,10,63].

Anwendung der entwickelten Methodik zum Testen von offiziellen Insulinpräparaten

Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Variante der Säulenflüssigchromatographie, bei der die mobile Phase - das Elutionsmittel - durch das Sorbens, das die Säule füllt, aufgrund eines erheblichen Drucks (bis zu 400 × 10 5 Pa) am Eingang der Säule mit hoher Geschwindigkeit passiert [11].

Zur Analyse komplexer Stoffgemische erschien die HPLC vor etwas mehr als 30 Jahren. Die Verwendung von Sorbentien mit einem Partikeldurchmesser von 3–10 μm bewirkte eine deutliche Steigerung der Effizienz der chromatographischen Trennung im Vergleich zu der klassischen Version der Säulenchromatographie. Daher wird HPLC oft als Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bezeichnet. Instrumentelle Merkmale der Verwendung von HPLC sind in zahlreichen Handbüchern [49.50] und in den entsprechenden Abschnitten des führenden Arzneibuchs [79,150] ausführlich beschrieben. Für die HPLC wurde ein breites Spektrum an Sorbentien entwickelt, das gerade produziert wird. Nach Angaben der Autoren der Umfrage [51] produzieren rund 100 Unternehmen weltweit mehr als 300 Arten von Sorbensnamen. Die Geschichte, der aktuelle Stand und die Aussichten für die Entwicklung der Methode werden in den Reviews [51] und [77.78] diskutiert.

In seinen verschiedenen Varianten wird die HPLC-Methode häufig in der pharmazeutischen Analyse (Produktionskontrolle und Prüfung der Arzneimittelqualität) eingesetzt. Die Methode ist in allen führenden Pharmakopöen der Welt enthalten. Diese Methode ist in den europäischen und amerikanischen Arzneibüchern am besten beschrieben. HPLC wird verwendet, um Arzneimittel zu identifizieren, die Reinheit, die Zusammensetzung des Molekulargewichts und die quantitative Analyse zu bestimmen. In den US Pharmacopoeia 28 Ed. Etwa 30% der privaten Artikel beinhalten die Verwendung von HPLC. Im Europäischen Arzneibuch 4. diese Zahl beträgt etwa 40%.

Die erste chromatographische Methode für die Insulintestung war die Niederdruck-Gel-Ausschlußflüssigkeitschromatographie (GE ZhND). Das Prinzip der Trennung unter den Bedingungen der HPLC beruht auf der unterschiedlichen Fähigkeit von Molekülen unterschiedlicher Größe, in die Poren des neutralen Gels einzudringen, das als stationäre Phase dient. Der hydrodynamische Durchmesser des Insulinmonomers und -dimers ist proportional zu ihrem Molekulargewicht und beträgt 2,69 bzw. 5,50 nm [115].

Unter Verwendung der GE-IHDD-Methode wurde 1967 gezeigt, dass kommerzielle, durch Kristallisation gereinigte Insulinpräparate Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht enthalten, das das Molekulargewicht des Insulins übersteigt [63]. In den Chromatogrammen von Schweineinsulin wurden drei Peaks gefunden, die herkömmlicherweise als a-, b- und c-Komponenten bezeichnet werden. Seitdem wurde eine Reihe chromatographischer Systeme vorgeschlagen, um den Gehalt an Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht in Insulinpräparaten zu kontrollieren. Die Auftrennung erfolgte an stark quellenden Agarosexerogelen (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Oder Dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), 1-3 M-Lösungen von Essigsäure wurden als IF eingesetzt [127]. Die hohe Empfindlichkeit dieser Sorptionsmittel gegenüber Kompression bei Drücken, die den Quelldruck der Matrix übersteigen, macht diese Materialien für den Betrieb im HPLC-Modus ungeeignet.

Die Verwendung der Gel-Ausschlußflüssigkeitschromatographie bei hohen Drücken (GE HPLC) für die Insulinanalyse wurde 1980 erstmals beschrieben, nachdem harte makroporöse Sorbentien entwickelt worden waren, die mit Wasser verträglich waren und hohen Drücken widerstehen. In [151] wurde die Trennung auf den Säulen Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.) und Bondagel (Pharmacia) unter denaturierenden Bedingungen (Kombination von 7 M Lösung von Harnstoff, Mineralsäuren und nichtionischen Säuren) durchgeführt Reinigungsmittel). Die Notwendigkeit einer Insulinanalyse unter denaturierenden Bedingungen hängt mit der Fähigkeit von Insulin zusammen, sich in Lösung zu aggregieren. Für die Abtrennung von Insulin unter den Bedingungen der HPLC-HPLC wurde auch die Verwendung des "traditionellen" Eluenten Essigsäure beschrieben [152]. Die Verwendung von Essigsäure hat mehrere Vorteile - minimale Auswirkungen auf die native Struktur der getrennten Verbindungen, Verfügbarkeit, geringe Kosten. Darüber hinaus ist es eine wichtige Tatsache, dass Essigsäure die Verbindung von Insulin unterdrücken kann.

Gegenwärtig ist HPLC ghvd eine pharmakopoide Methode zur Überwachung des Gehalts an Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht in Substanzen und fertigen Dosierungsformen. Das Verfahren wird auch verwendet, um den Gehalt an Protamin in Isophan-Insulin-Präparaten zu bestimmen.

Die Verwendung von HPLC in Reversed Phase (RP-HPLC) für die Trennung von Insulin von Rindern und Schweinen zum ersten Mal zeigte die hohe Effizienz dieses Verfahrens für die Analyse von Insulin-ähnlichen Peptiden mit einer ähnlichen Struktur.

Der Mechanismus der Trennung von Proteinen und Polypeptiden unter den Bedingungen der RP-HPLC beruht auf der unterschiedlichen Hydrophobizität von Insulinmolekülen und verwandten Verunreinigungen. Bis heute wurden mehrere Dutzend Verfahren zur chromatographischen Trennung von Insulin verschiedener Herkunft und ihrer Derivate, einschließlich Proinsulin, Pankreaspolypeptide, Dezimido-Derivate, Insulindimer, beschrieben. [126] zeigten die Möglichkeit, Hühner-, Kaninchen-, Schaf- und Pferdeinsulin abzutrennen. Mensch, Rindfleisch und Schweineinsulin wurden ebenfalls getrennt. Lloyd und Corran veröffentlichten eine Methode zur Trennung von Rindfleisch, Schweinefleisch, menschlichen Insulinen und ihren entsprechenden desamidierten Formen [104].

Die Trennung erfolgt an modifizierten Silicagel-Sorbentien, Methyl-, Butyl-, Octyl-, Octadecyl- und Phenylgruppen im isokratischen oder Gradientenmodus. Als PF werden organische Modifizierungsmittel verwendet - Acetonitril, Methylalkohol, Isopropylalkohol, gemischt mit wässrigen Pufferlösungen, die anorganische Salze und Ionendampfreagenzien enthalten. Die Peakdetektion wird hauptsächlich spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 190-220 nm durchgeführt, auch fluorimetrische Methoden werden beschrieben [103].

Die Analyse der Substanz und der fertigen Darreichungsformen von Insulin mittels RP-HPLC ist in privaten Artikeln des amerikanischen und europäischen Arzneibuchs beschrieben [79,150]. Das Verfahren wird verwendet, um Arzneimittel der angegebenen Gruppe im Hinblick auf "Insulin-Authentizität", "Verwandte Proteine", "Quantitative Bestimmung" und "Insulin in Lösung" zu testen.

In der Forschungsliteratur wird auch die Verwendung von Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie für die Insulinanalyse beschrieben [44,102], jedoch wurden diese Verfahren in der Pharmakopoepraxis nicht weit verbreitet.

Die Wahl der Bedingungen für die chromatographische Bestimmung von Protamin in den Dosierungsformen von Isophan-Insulin

Eine Erhöhung der PF-Ionenstärke führt in der Regel zu einer Erhöhung der Insulinkapazitätsverhältnisse, die durch eine Reihe von Faktoren verursacht werden kann: - Durch Erhöhung der Ionenkonzentration wird der Ionisierungsgrad der geladenen Gruppen des Proteinmoleküls verringert. Die Erhöhung der Hydrophobizität / hohe Kationenkonzentration trägt zum Screening freier Silanolgruppen auf der Oberfläche bei eine Phase, die die unspezifische elektrostatische Wechselwirkung der protonierten Aminogruppen des Proteins mit der Matrix schwächt; - Hohe Ionenstärke beeinflusst die räumliche Struktur von Insulin, wodurch sich die für die Wechselwirkung mit dem Sorptionsmittel zur Verfügung stehende Oberfläche ändert. Die Konzentration anorganischer Salze im FS beeinflusst die Form der Peaks und die Selektivität der Trennung von Insulin und Desamido-Asn-Insulin [143,144]. Bei isokratischer Elution von LiChrosorb®-Sorbens mit 0,1 M Natriumphosphatlösung (pH 2,3) wurde ein zufriedenstellendes Ergebnis nur erzielt, wenn der Pufferlösung Natriumsulfat in einer Konzentration von 0,1 M zugesetzt wurde. Die meisten Insulinanalyseverfahren, die in pharmakopoetischen Artikeln und ND enthalten sind PF auf der Basis von Pufferlösungen mit einem Natriumsulfatgehalt von 0,2 M verwenden. Ein derart hoher Gehalt an Natriumsulfat beeinflusst die Reproduzierbarkeit der Chromatographieergebnisse aufgrund der Stratifizierung von Eluenten negativ. Hochkonzentrierte Salzlösungen wirken sich negativ auf chromatographische Geräte aus und verkürzen die Lebensdauer. In Anbetracht der Tatsache, dass die pharmakopoetischen Analysemethoden vor mehr als 20 Jahren entwickelt wurden, erschien es interessant, das chromatographische Verhalten von Insulin unter OF-HPLC an den chromatographischen Sorbentien der neuesten Generation in Abhängigkeit von der Natriumsulfatkonzentration zu untersuchen. Gleichzeitig versuchten sie herauszufinden, ob eine Verringerung des Natriumsulfatgehalts in PF zulässig ist, ohne dass die Trennfähigkeit des chromatographischen Systems wesentlich beeinträchtigt wird. Als Ergebnis der Forschung wurde festgestellt, dass die Wirkung der Natriumsulfatkonzentration im PF je nach Art der gepfropften Phase sowie der Insulinsorte unterschiedlich ist. Auf Sorbentien mit aufgepfropften Gruppen C4 und C Die Selektivität der Trennung von Peaks von Humaninsulin und Desamido-Asn-Humaninsulin hängt nicht von der Natriumsulfatkonzentration in ab. Puffer1-Lösung im Bereich von 0,05 M bis 0,2 M. Beim Diaspher-110-C18-Sorbens hat die Trennungsselektivität dieses Peakpaares ein Maximum bei 0,05 M und ein Minimum bei 0,1 M (Diagramm 4). Andererseits hängt die Selektivität der Trennung von Insulin-Tierarten und ihren entsprechenden desamidierten AsnA21-Formen nicht von der Ionenstärke der Lösung ab, wenn sie vom Sorbens Diasphere-110-C18 getrennt wird. Bei einem Sorbens mit C8-gepfropften Gruppen steigt die Selektivität von 1,25 auf 1,28 mit einer Erhöhung der Natriumsulfatkonzentration (4). Bei einem Sorbens mit C4-gepfropften Gruppen ist die Trennungsselektivität bei Rindinsulin bei 0,1 M Natriumsulfat maximal und bei 0,2 M minimal. Bei Schweineinsulin gibt es bei 0,1 M Natriumsulfatkonzentration kein ausgeprägtes Maximum, in diesem Fall eine Erhöhung der Ionensäure Kräfte führten zu einer Abnahme der Trennselektivität (Abbildung 4). Die Anzahl der effektiven theoretischen Trennstufen nimmt mit zunehmender Natriumsulfatkonzentration zu. Die Ausnahme ist das Verhalten von Humaninsulin auf dem Sorbens Diasfer-110-C8 (Abbildung 5). Der Trennungsgrad von Insulin-Peaks und Desamido-Asn-Insulin steigt mit zunehmender Ionenstärke des FS unabhängig von der Insulinart und der Art der aufgepfropften Phase an (Diagramm b). Durch Verringern der Natriumsulfatkonzentration von 0,2 M auf 0,1 M nimmt der Trennungsgrad des ausgewählten Peaks von Peaks im Durchschnitt um 5% für Human- und Schweineinsuline und um 10% für Rindinsulin ab. In Anbetracht der Tatsache, dass der absolute Wert des Trennungsgrades 2,0 überschreitet, ist die gemessene Verschlechterung der Trennkapazität der Kolonne unseres Erachtens nicht signifikant. Folglich kann die Konzentration von Natriumsulfat in der Pufferlösung PF im Vergleich zu den pharmakopoetischen Analysemethoden um das Zweifache reduziert werden.

In den meisten Studien zur Analyse von Proteinen und Peptiden wird die Trennung bei Raumtemperatur durchgeführt. Darüber hinaus weisen einige Autoren darauf hin, dass der Einfluss der Temperatur auf die Trennselektivität minimal ist [48]. Mit steigender Temperatur wird jedoch der Massenaustausch zwischen der stationären und der mobilen Phase beschleunigt, was zu einer Verringerung der Retentionszeit von Peptiden und einer Verengung der Peaks führt.

Insulin-Technologie

Verletzung der Insulinsekretion. Die Verwendung von Affiliate-Fotografie. Schema für Insulin. Expression von Proinsulin in E. coli-Zellen. Ansätze zur Lösung des Diabetesproblems. Der Beitrag der Biotechnologie zur industriellen Produktion von Nicht-Peptid-Hormonen.

Senden Sie Ihre gute Arbeit in der Wissensdatenbank einfach. Verwenden Sie das untenstehende Formular.

Studenten, Doktoranden und junge Wissenschaftler, die die Wissensbasis in Studium und Arbeit nutzen, werden Ihnen sehr dankbar sein.

Gepostet am http://www.allbest.ru/

Gepostet am http://www.allbest.ru/

Gepostet am http://www.allbest.ru/

MINISTERIUM FÜR BILDUNG UND WISSENSCHAFT DER REPUBLIK KASACHSTAN

KAZAKH AGRO-TECHNISCHE UNIVERSITÄT NACH S. SEYFULLIN GENANNT

Abteilung für Mikrobiologie und Biotechnologie

Zur Disziplin "Biotechnologie mokroorganizmov"

Zum Thema: Technologie für Insulin

Abgeschlossen: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Überprüft: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE

1. Geschichte der Entdeckung

2. Insulin in der Biotechnologie bekommen

3. Möglichkeiten, menschliches Insulin zu bekommen

4. Expression von Proinsulin in E. coli-Zellen

5. Reinigung von Insulin

6. Dosierung und Verabreichung

In dieser Kursarbeit wurden folgende Definitionen verwendet:

Proteinträger - Bereitstellung des Transports des Hybridproteins im periplasmatischen Raum der Zelle oder des Kulturmediums;

Affinitätskomponente - Erleichtert die Auswahl eines Hybridproteins erheblich.

Insulin (aus dem Lateinischen Insula - die Insel) - ein Peptidhormon, wird in den Betazellen der Langerhans-Inseln des Pankreas gebildet.

Interleukine sind eine Gruppe von Zytokinen, die hauptsächlich von Leukozyten synthetisiert werden (aus diesem Grund wurde die Endung "-leukin" gewählt).

Proinsulin ist ein Vorläufer von Insulin, das von den B-Zellen des Insularapparates der Bauchspeicheldrüse synthetisiert wird.

Chromatographie (aus dem Griechischen. Chroma, Chromatos - Farbe, Farbe), physikalisch-chemische Methode der Trennung und Analyse von Gemischen, basierend auf der Verteilung ihrer Komponenten zwischen den beiden Phasen - stationär und beweglich (Eluent) -, die durch das stationäre fließen.

Encapsulation - Ein Programmiersprachenmechanismus, der den Zugriff auf die Komponenten (Methoden und Eigenschaften) eines Objekts einschränkt, sie privatisiert, dh nur innerhalb eines Objekts zugänglich macht.

Ein Fusionsprotein (Fusionsprotein, auch ein chimäres Verbindungsprotein) ist ein Protein, das durch Kombinieren von zwei oder mehr Genen erhalten wird, die ursprünglich getrennte Proteine ​​kodierten.

Hormone (aus dem Griechischen. Hormao - in Bewegung setzen, induzieren), Hormone, biologisch aktive Substanzen, die von den endokrinen Drüsen oder endokrinen Drüsen produziert und von diesen direkt in das Blut abgegeben werden.

Diabetes mellitus ist eine Gruppe endokriner Erkrankungen, die sich als Folge einer absoluten oder relativen Insuffizienz des Hormons Insulin entwickeln.

Encapsulation - Ein Programmiersprachenmechanismus, der den Zugriff auf die Komponenten (Methoden und Eigenschaften) eines Objekts einschränkt, sie privatisiert, dh nur innerhalb eines Objekts zugänglich macht.

Somatostatin ist ein Hormon der Delta-Zellen der Pankreasinseln von Langerhans sowie eines der Hormone des Hypothalamus.

Die Radioimmunanalyse ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung biologisch aktiver Substanzen (Hormone, Enzyme, Arzneimittel usw.) in biologischen Flüssigkeiten, basierend auf der kompetitiven Bindung der gewünschten stabilen und ihnen ähnlichen Radionuklid-markierten Substanzen mit spezifischen Bindungssystemen.

ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE

HPLC - Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

cDNA - komplementäre Desoxyribonukleinsäure

Die Hauptfunktion von Insulin besteht darin, die Permeabilität von Zellmembranen für Glucosemoleküle sicherzustellen. In vereinfachter Form kann gesagt werden, dass nicht nur Kohlenhydrate, sondern auch alle Nährstoffe letztendlich in Glukose gespalten werden, die zur Synthese anderer kohlenstoffhaltiger Moleküle verwendet wird und die einzige Art von Brennstoff für zellulare Kraftwerke ist - Mitochondrien. Ohne Insulin sinkt die Durchlässigkeit der Zellmembran für Glukose um das 20fache, und die Zellen verhungern, und der im Blut gelöste überschüssige Zucker vergiftet den Körper.

Die Insulinsekretionsstörung aufgrund der Zerstörung der Betazellen - absoluter Insulinmangel - ist ein Schlüsselelement bei der Pathogenese des Typ-1-Diabetes mellitus. Die Verletzung der Wirkung von Insulin auf das Gewebe - relativer Insulinmangel - spielt bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes eine wichtige Rolle.

Die Verwendung der Affinitätschromatographie hat den Gehalt an verunreinigenden Proteinen in der Zubereitung mit einem höheren Molekulargewicht als Insulin signifikant verringert. Solche Proteine ​​umfassen Proinsulin und teilweise gespaltene Proinsuline, die die Produktion von Antiinsulin-Antikörpern induzieren können.

Die Verwendung von Humaninsulin von Anfang an minimiert das Auftreten allergischer Reaktionen. Humaninsulin wird schneller resorbiert und hat unabhängig von der Form des Arzneimittels eine kürzere Wirkungsdauer als tierisches Insulin. Menschliche Insuline sind weniger immunogen als Schweinefleisch, insbesondere Rinder- und Schweineinsuline.

Ziel dieser Kursarbeit ist es, die Insulintechnologie zu untersuchen. Zur Erreichung der Ziele wurden folgende Ziele gesetzt:

1. Insulin in der Biotechnologie bekommen

2. Möglichkeiten, Insulin zu bekommen

H. Insulinreinigung

Die Geschichte der Insulinentdeckung ist mit dem Namen des russischen Arztes I.M. Sobolev (zweite Hälfte des 19. Jahrhunderts), der bewies, dass der Zuckerspiegel im menschlichen Blut durch ein spezielles Hormon der Bauchspeicheldrüse reguliert wird.

Im Jahr 1922 wurde Insulin aus der Bauchspeicheldrüse eines Tieres erstmals einem zehnjährigen Jungen vorgestellt, ein Diabetiker übertraf alle Erwartungen und ein Jahr später veröffentlichte die amerikanische Firma Eli Lilly das erste tierische Insulinpräparat.

Nachdem in den nächsten Jahren die erste industrielle Insulinsubstanz erhalten worden war, wurde ein großer Weg ihrer Isolierung und Reinigung abgedeckt. Infolgedessen wurde das Hormon für Patienten mit Typ-1-Diabetes verfügbar.

Im Jahr 1935 optimierte der dänische Forscher Hagedorn die Wirkung von Insulin im Körper, indem er ein verlängertes Medikament vorschlug.

Die ersten Insulinkristalle wurden 1952 erhalten, und 1954 entschlüsselte der englische Biochemiker G. Senger die Struktur von Insulin. Die Entwicklung von Methoden zur Reinigung des Hormons von anderen hormonellen Substanzen und Produkten des Insulinabbaus ermöglichte die Gewinnung von homogenem Insulin, dem sogenannten Einkomponenteninsulin.

Anfang der 70er Jahre. Die sowjetischen Wissenschaftler A. Yudaev und S. Shvachkin schlugen eine chemische Insulinsynthese vor, die Umsetzung dieser Synthese im industriellen Maßstab war jedoch teuer und unrentabel.

In der Zukunft verbesserte sich der Reinigungsgrad von Insulinen progressiv, wodurch die durch Insulinallergien, Nierenfunktionsstörungen, Sehstörungen und Immuninsulinresistenz verursachten Probleme reduziert wurden. Das wirksamste Hormon wurde für die Substitutionstherapie bei Diabetes mellitus benötigt - homologes Insulin, dh Humaninsulin.

In den 80er Jahren ermöglichten die Fortschritte in der Molekularbiologie die Synthese sowohl der menschlichen Insulinketten mit E. coli, die dann zu einem biologisch aktiven Hormonmolekül kombiniert wurden, als auch rekombinantes Insulin unter Verwendung von gentechnisch hergestellten E. coli-Stämmen am Institut für Bioorganische Chemie.

2. Insulin in der Biotechnologie bekommen

Insulin, ein Peptidhormon der Pankreasinseln von Langerhans, ist die Hauptbehandlung bei Diabetes mellitus. Diese Krankheit wird durch Insulinmangel verursacht und äußert sich in einem Anstieg des Blutzuckerspiegels. Bis vor kurzem wurde Insulin aus der Bauchspeicheldrüse eines Stiers und eines Schweins gewonnen. Das Medikament unterschied sich von Humaninsulin-1-3-Aminosäuresubstitutionen, so dass insbesondere bei Kindern allergische Reaktionen drohten. Der therapeutische Einsatz von Insulin in großem Maßstab wurde durch seine hohen Kosten und begrenzten Ressourcen eingeschränkt. Durch chemische Modifikation wurde Insulin von Tieren vom Menschen nicht unterscheidbar gemacht, dies bedeutete jedoch eine zusätzliche Steigerung der Produktkosten. [1]

Seit 1982 produziert Eli Lilly gentechnisch hergestelltes Insulin, das auf einer separaten Synthese von E. colie- und B-Ketten basiert. Die Kosten des Produkts sind deutlich gesunken, das produzierte Insulin ist mit dem Menschen identisch. Seit 1980 gibt es in der Presse Berichte über das Klonieren des Proinsulingens, einer Vorstufe des Hormons, das mit eingeschränkter Proteolyse in eine reife Form übergeht.

Die Technologie der Verkapselung ist auch an die Behandlung von Diabetes gebunden: Pankreaszellen in einer Kapsel, die einmal in den Körper des Patienten eingeführt werden, produzieren Insulin innerhalb eines Jahres.

Integrated Genetics hat die Produktion von follikelstimulierenden und luteinisierenden Hormonen gestartet. Diese Peptide bestehen aus zwei Untereinheiten. Auf der Tagesordnung steht die Frage nach der industriellen Synthese von Oligopeptidhormonen des Nervensystems, Ankephalinen, die aus 5 Aminosäureresten aufgebaut sind, und Endorphinen, Morphinanaloga. Durch den rationellen Einsatz dieser Peptide werden Schmerzen gelindert, eine gute Stimmung geschaffen, die Effizienz gesteigert, die Aufmerksamkeit konzentriert, das Gedächtnis verbessert, der Schlaf und die Wachheit in Ordnung gebracht. Ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung gentechnischer Verfahren ist die Synthese von β-Endorphin unter Verwendung der oben beschriebenen Hybridprotein-Technologie für ein anderes Peptidhormon, Somatostatin [2].

3. Möglichkeiten, menschliches Insulin zu bekommen

Historisch gesehen besteht der erste Weg, Insulin für therapeutische Zwecke zu erhalten, darin, Analoga dieses Hormons aus natürlichen Quellen (Pankreasinseln von Rindern und Schweinen) zu isolieren. In den 20er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde festgestellt, dass Rinder- und Schweineinsuline (die in Struktur und Aminosäuresequenz dem Humaninsulin am nächsten liegen) eine im menschlichen Körper vergleichbare Aktivität aufweisen, die mit Humaninsulin vergleichbar ist. Danach wurde Rinder- oder Schweineinsulin lange Zeit zur Behandlung von Patienten mit Typ-1-Diabetes verwendet. Nach einiger Zeit zeigte sich jedoch, dass sich in einigen Fällen Antikörper gegen Rinder- und Schweineinsuline im menschlichen Körper ansammeln, wodurch deren Wirkungen zunichte gemacht werden.

Andererseits ist einer der Vorteile dieser Methode zur Gewinnung von Insulin die Verfügbarkeit von Rohstoffen (Rinder- und Schweineinsulin können leicht in großen Mengen gewonnen werden), die eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der ersten Methode zur Gewinnung von Humaninsulin gespielt haben. Diese Methode wird halbsynthetisch genannt [3].

Bei diesem Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin wurde Schweineinsulin als Rohmaterial verwendet. Gereinigtes Schweineinsulin wurde durch das C-terminale Octapeptid der B-Kette gespalten, wonach das C-terminale Octapeptid von Humaninsulin synthetisiert wurde. Dann wurde es chemisch gebunden, die Schutzgruppen wurden entfernt und das erhaltene Insulin wurde gereinigt. Beim Testen dieser Methode zur Gewinnung von Insulin wurde die vollständige Identität des erhaltenen Hormons gegenüber Humaninsulin gezeigt. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht in den hohen Kosten des resultierenden Insulins (selbst jetzt ist die chemische Synthese von Octapeptid insbesondere im industriellen Maßstab teuer).

Gegenwärtig wird menschliches Insulin hauptsächlich auf zwei Wegen erhalten: durch Modifizieren von Schweineinsulin durch ein synthetisch-enzymatisches Verfahren und durch ein gentechnisches Verfahren.

Im ersten Fall basiert das Verfahren auf der Tatsache, dass sich Schweineinsulin durch eine einzige Substitution am C-Terminus der Ala30Thr-B-Kette von Humaninsulin unterscheidet. Der Austausch von Alanin durch Threonin erfolgt durch die enzymkatalysierte Spaltung von Alanin und stattdessen das Anbringen eines carboxylgeschützten Threoninrests, der in der Reaktionsmischung vorhanden ist, in einem großen Überschuß. Nach Abspaltung der schützenden O-tert-Butylgruppe wird Humaninsulin erhalten. (Bild 1)

Abbildung 1 - Schema von Methoden zur Herstellung von Humaninsulin

Insulin war das erste Protein, das für kommerzielle Zwecke unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie erhalten wurde. Es gibt zwei Hauptansätze zur Gewinnung von gentechnisch hergestelltem Humaninsulin. Im ersten Fall produzieren getrennte (unterschiedliche Produzentenstämme) beide Ketten, gefolgt von der Faltung des Moleküls (Bildung von Disulfidbrücken) und der Trennung der Fehlform. Im zweiten Schritt erfolgt die Herstellung in Form eines Vorläufers (Proinsulin), gefolgt von einer enzymatischen Spaltung mit Trypsin und Carboxypeptidase. In die aktive Form des Hormons. Derzeit ist die Produktion von Insulin als Vorläufer am meisten bevorzugt, um den korrekten Verschluss von Disulfidbrücken zu gewährleisten (im Falle der getrennten Produktion von Ketten werden aufeinanderfolgende Denaturierungszyklen, Trennung der Fehlformierung und Renaturierung durchgeführt) [3].

Bei beiden Ansätzen ist es möglich, sowohl einzeln die Ausgangskomponenten (A- und B-Ketten oder Proinsulin) als auch als Teil von Hybridproteinen zu erhalten. Neben A- und B-Ketten oder Proinsulin können Hybridproteine ​​in der Zusammensetzung enthalten sein:

1) Trägerprotein - Sicherstellung des Transports des Hybridproteins in den periplasmatischen Raum der Zelle oder des Kulturmediums;

2) Affinitätskomponente - Erleichtert signifikant die Auswahl eines Hybridproteins.

Zur gleichen Zeit können beide Komponenten gleichzeitig in der Zusammensetzung des Hybridproteins vorhanden sein. Bei der Herstellung von Hybridproteinen kann zudem das Prinzip der Multidimensionalität verwendet werden (dh es befinden sich mehrere Kopien des Zielpolypeptids im Hybridprotein), wodurch die Ausbeute des Zielprodukts signifikant gesteigert werden kann [4].

Wir haben den Stamm JM 109 N1864 mit einer Nukleotidsequenz verwendet, die in ein Plasmid eingebettet ist, das ein Hybridprotein exprimiert, das aus linearem Proinsulin und einem Fragment eines Astaphylococcusaureus-Proteinfragments besteht, das an seinen N-Terminus über einen Methioninrest gebunden ist. Die Kultivierung der gesättigten Biomasse von Zellen des rekombinanten Stammes stellt den Beginn der Produktion des Hybridproteins sicher, dessen Isolierung und sequentielle Transformation durch die Intube zu Insulin führt. Eine andere Gruppe von Forschern erhielt im bakteriellen Expressionssystem ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus humanem Proinsulin und einem über einen Methioninrest daran angebundenen Polyhistidin-Schwanz. Es wurde mittels Chelat-Chromatographie an Ni-Agarose-Säulen aus Einschlusskörpern isoliert und mit Bromcyan digeriert. Die Autoren haben festgestellt, dass das isolierte Protein S-sulfuriert ist. Die Kartierung und Massenspektrometrieanalyse des erhaltenen Proinsulins, gereinigt durch Ionenaustauschchromatographie an Anionenaustauschern und RP (Umkehrphasen) HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie), zeigte das Vorhandensein von Disulfidbrücken, die den Disulfidbrücken von nativem humanem Proinsulin entsprachen. Es berichtete auch über die Entwicklung einer neuen, verbesserten Methode zur Gewinnung von Humaninsulin durch gentechnische Methoden in prokaryotischen Zellen. Die Autoren fanden heraus, dass das in seiner Struktur und biologischen Aktivität erhaltene Insulin mit dem aus der Bauchspeicheldrüse isolierten Hormon identisch ist [5].

In letzter Zeit wurde besonderes Augenmerk auf die Vereinfachung des Verfahrens zur Herstellung von rekombinantem Insulin durch gentechnische Verfahren gelegt. So wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus einem Interleukin-Leaderpeptid, das an den N-Terminus von Proinsulin gebunden ist, über einen Lysinrest erhalten. Das Protein wurde in Einschlusskörpern effizient exprimiert und lokalisiert. Nach der Isolierung wurde das Protein mit Trypsin gespalten, um Insulin und C-Peptid herzustellen. Eine andere Gruppe von Forschern verhielt sich ähnlich. Das Fusionsprotein, bestehend aus Proinsulin und zwei synthetischen Domänen von Staphylococcus-Protein A, die IgG binden, war in Einschlusskörpern lokalisiert, hatte jedoch ein höheres Expressionsniveau. Das Protein wurde durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von IgG isoliert und mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt. Das resultierende Insulin und C-Peptid wurden mittels RP-HPLC gereinigt. Bei der Herstellung von Fusionsstrukturen ist das Massenverhältnis des Trägerproteins zum Zielpolypeptid sehr signifikant. So wird das Design von Fusionskonstrukten beschrieben, bei dem ein Protein, das humanes Serumalbumin bindet, als Trägerpolypeptid verwendet wurde. Ein, drei und sieben C-Peptide waren daran gebunden. C-Peptide wurden auf Kopf-Schwanz-Basis unter Verwendung von Aminosäure-Spacern kombiniert, die die Sfi I-Restriktionsstelle und zwei Argininreste am Anfang und am Ende des Spacers tragen, um das Protein anschließend mit Trypsin zu spalten. HPLC-Spaltprodukte zeigten, dass C-Peptid quantitativ gespalten wird, und dies ermöglicht die Verwendung multimärer synthetischer Gene, um Zielpolypeptide im industriellen Maßstab herzustellen.

Gewinnung von mutiertem Proinsulin, das den Ersatz von Arg32Tyr enthielt. Bei der gemeinsamen Spaltung dieses Proteins mit Trypsin und Carboxypeptidase B wurden natives Insulin und C-Peptid mit einem Tyrosinrest gebildet. Letzteres wird nach dem 125I-Tagging aktiv im Radioimmunoassay eingesetzt [6].

Insulin-Qualitätskontrolle

Der Inhalt

1. Allgemeine Informationen zum Erhalt von Insulin 5

2. Methoden zur Kontrolle der Insulinqualität 8

Referenzen 17

Auszug aus der Arbeit

1-2% der europäischen Bevölkerung leidet an Diabetes, und etwa 20% dieser Patienten können ohne Insulinspritzen nicht existieren. Seit den ersten Versuchen zur Verwendung von Insulin zur Behandlung von Diabetes im Jahr 1922 wurde dieses Hormon aus dem Pankreas von Tieren (Kühen und Schweinen) isoliert. Tierisches Insulin unterscheidet sich geringfügig in der Aminosäuresequenz von Humaninsulin.

Human- und Schweineinsuline sind besonders eng: Bei Schweineinsulin wird das C-terminale Threonin der B-Kette durch Alanin ersetzt. Kuh- und Humaninsulin unterscheiden sich in drei Aminosäureresten. Diese Unterschiede haben die erhöhte immunogene Aktivität von Rinderinsulin im Vergleich zu Schweineinsulin bestimmt.

Fast alle Patienten, die mit Kuhinsulin behandelt wurden, wiesen Antikörper gegen Insulin im Blut auf. Die antigenen Eigenschaften von Insulin wurden auch teilweise durch Verunreinigungen in seinen Präparaten bestimmt. Am wahrscheinlichsten war es die Bildung von Antikörpern gegen Insulin, die einige geringfügige Nebenwirkungen bei der Injektion von Kuhinsulin erklärte, zum Beispiel die Atrophie des subkutanen Fetts an der Wiederinjektionsstelle. Im Falle von hochreinem Insulin waren diese Effekte nicht vorhanden.

Anschließend wurde dank Gentechnik und unter Verwendung von E. Coli Humaninsulin erhalten.

Humaninsulin, gewonnen durch E. coli, war das erste "gentechnisch veränderte" Protein, das an Menschen getestet wurde. In Versuchen mit gesunden Freiwilligen wurde festgestellt, dass es sicher ist (keine allergischen und anderen unerwünschten Reaktionen hervorruft) und die Fähigkeit hat, den Blutzuckerspiegel zu senken, wenn es unter die Haut oder intravenös verabreicht wird.

Derzeit wird solches Humaninsulin von vielen Diabetikern weltweit gewonnen. Diesem waren klinische Versuche vorausgegangen, in denen metabolische Veränderungen und immunologische Wirkungen untersucht wurden.

Die Relevanz unseres Themas ist, dass eine unkontrollierte oder schlecht kontrollierte Produktion zur Freisetzung kontaminierter Insulinpräparate führen kann, was wiederum zu nachteiligen klinischen Folgen führen kann.

Ziel dieser Arbeit ist es, die Methoden zur Qualitätskontrolle von Insulin zu untersuchen.

Referenzliste

GOST R 52249-2004 "Regeln für die Herstellung und Qualitätskontrolle von Arzneimitteln" 2004

OFS 42-0002-00 "Bakterielle Endotoxine" 2000

OFS 42-0126-09 "Biologische Insulintests"

Arzneibuchartikel der Russischen Föderation FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Gentechnik für Humaninsulin: Erfolge und Perspektiven // Russische chemische Zeitschrift. - 2005. - T. XLIX. - Nr. 1 - S. 34-45.

Goncharenko G.G. Grundlagen der Biotechnologie: Lehrmethode. Komplex für Stud.biolog. speziell / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. RB. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 p.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Anwendung der kinetisch-chromogenen Methode zur Bestimmung des bakteriellen Endotoxins (LAL-Test) in der Reinigungstechnologie von gentechnisch hergestelltem Humaninsulin // Biopharmaceutical Journal - 2009. - Vol. 1. - №1. - S. 34-37.