Insulinproduktionstechnologie

• Prävention

Insulin ist eines der Hormone, die der menschliche Körper selbst produziert, insbesondere die Bauchspeicheldrüse. Die Verletzung der Sekretion dieser Substanz führt zur Entstehung einer so schweren Erkrankung wie Diabetes. Für seine Behandlung mit einem synthetischen Hormon, das lange Zeit aus dem Pankreas von Tieren isoliert wurde. Die Technologie zur Herstellung von Insulin mit Hilfe eines sehr verbreiteten Bakteriums - Escherichia coli oder Hefepilz - wird jedoch seit geraumer Zeit eingesetzt. Mit dieser Methode können Sie allergische Reaktionen vermeiden, die durch Fremdprotein hervorgerufen werden. Dies unterscheidet sich geringfügig vom Menschen.

Technologisches Schema

Die Produktionstechnologie von Insulin umfasst alle Hauptschritte der Herstellung von Biotech-Produkten. Das Ergebnis ist ein kristallines Endprodukt, das dann zur Herstellung von Injektionslösungen verwendet wird, die zur Behandlung von schwerem Diabetes mellitus Typ I und II verwendet werden. Die Hauptwirkung dieses Hormons im Körper äußert sich in einer Abnahme des Blutzuckerspiegels.

Die Stufen der Insulinproduktion sind wie folgt:

• Vorläufig Sie führt solche Vorgänge aus, wie die Aufbereitung und Reinigung von Wasser und Luft, die Reinigung von Industrieanlagen und die Sterilisation von Ausrüstung, die Überprüfung von Personal, die Verarbeitung von Händen und die Ausgabe von sterilen Schuhen und Kleidungsstücken. Ebenfalls im Vorstadium wird die primäre chemische Synthese der Molekülketten durchgeführt, aus denen das Protein aufgebaut ist. Kette A enthält 21 Aminosäurereste und Kette B enthält 30 Aminosäuren.
• Zubereitung von Nährlösungen und Zellkultur. Damit eine lebende Zelle die notwendige Verbindung herstellen kann, wird das entsprechende Gen eingeführt. Dazu wird das Plasmid von speziellen Enzymen, Restriktionen, geschnitten und die Gene, die für die Synthese der notwendigen Verbindungen kodieren, darin eingenäht. Dann wird das modifizierte Plasmid unter Verwendung einer Mikroinjektionsmethode in die Zelle zurückgegeben.
• Kultivierung der Zellsuspension. Gentechnisch veränderte Zellen werden in eine Nährlösung gegeben, die alle für das Wachstum und die Fortpflanzung notwendigen Bestandteile enthält und sterilisiert wird. Die Kultivierung der Kultur erfolgt in speziellen Bioreaktoren, in die die vorgereinigte Luft eingespeist wird. In regelmäßigen Abständen wird eine bestimmte Menge Nährlösung in den Reaktor gegeben und gleichzeitig das gleiche Volumen der Zellsuspension entnommen.
• Die Zuteilung von Kultur. Die Trennung von Flüssigkeit und Zellkultur erfolgt durch Sedimentation (Sedimentation) in speziellen Sedimentatoren und anschließender Filtration, wodurch die Integrität der Zellen erhalten werden kann.
• Chromatographische Reinigung der Substanz. Es wird auf der geeigneten Ausrüstung unter Verwendung verschiedener Verfahren durchgeführt, insbesondere der Frontal-, Anionenaustausch- und Gelpermeationschromatographie.
• Proteinmolekül bekommen. Im eigentlichen Biotech-Stadium erfolgt die Synthese eines nicht produzierten Insulinmoleküls. Und die zwei Komponenten seiner Ketten. Sie werden nach Oxidation und Faltung der erhaltenen Ketten zusammengenäht, wodurch sich Disulfidbrücken bilden.
• Gefriertrocknung in einem speziellen Ofen, wonach die resultierende kristalline Zubereitung auf Übereinstimmung mit dem Standard geprüft, verpackt, etikettiert und an den Verbraucher versandt wird.

Unser Unternehmen bietet zu günstigen Bedingungen fertige Produktionslinien an, bei denen die gesamte Technologie der Insulinproduktion vollständig eingehalten wird. Dank präziser Berechnungen, technischer Unterstützung und Informationsunterstützung sowie einer Schulung des Personals im Rahmen eines umfassenden Programms ist das Unternehmen profitabel und die Produkte sind gefragt.

Insulinsorten und Verfahren zu ihrer Herstellung

1. Arten von Insulin

2. Insulin bekommen

Insulin (aus dem lateinischen Insula-Island) ist ein Peptidhormon, das in den Betazellen der Pankreasinseln von Langerhans gebildet wird. Es hat eine vielfältige Wirkung auf den Stoffwechsel in fast allen Geweben.

Die Hauptfunktion von Insulin besteht darin, die Permeabilität von Zellmembranen für Glucosemoleküle sicherzustellen. In vereinfachter Form können wir sagen, dass nicht nur Kohlenhydrate, sondern auch alle Nährstoffe letztendlich in Glukose gespalten werden, die zur Synthese anderer kohlenstoffhaltiger Moleküle verwendet wird und der einzige Brennstoff für zelluläre Kraftwerke ist - Mitochondrien. Ohne Insulin sinkt die Durchlässigkeit der Zellmembran für Glukose um das 20fache, und die Zellen verhungern, und der im Blut gelöste überschüssige Zucker vergiftet den Körper.

Die Insulinsekretionsstörung aufgrund der Zerstörung der Betazellen - absoluter Insulinmangel - ist ein Schlüsselelement bei der Pathogenese des Typ-1-Diabetes mellitus. Die Verletzung der Wirkung von Insulin auf das Gewebe - relativer Insulinmangel - spielt bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes eine wichtige Rolle.

Die Geschichte der Insulinentdeckung ist mit dem Namen des russischen Arztes I.M. Sobolev (zweite Hälfte des 19. Jahrhunderts), der bewies, dass der Zuckerspiegel im menschlichen Blut durch ein spezielles Hormon der Bauchspeicheldrüse reguliert wird.

Im Jahr 1922 wurde Insulin, das aus der Bauchspeicheldrüse eines Tieres isoliert worden war, erstmals einem zehnjährigen Diabetiker verabreicht. Das Ergebnis übertraf alle Erwartungen und ein Jahr später veröffentlichte die amerikanische Firma Eli Lilly das erste tierische Insulinpräparat.

Nachdem in den nächsten Jahren die erste industrielle Insulinsubstanz erhalten worden war, wurde ein großer Weg ihrer Isolierung und Reinigung abgedeckt. Infolgedessen wurde das Hormon für Patienten mit Typ-1-Diabetes verfügbar.

Im Jahr 1935 optimierte der dänische Forscher Hagedorn die Wirkung von Insulin im Körper, indem er ein verlängertes Medikament vorschlug.

Die ersten Insulinkristalle wurden 1952 erhalten, und 1954 entschlüsselte der englische Biochemiker G.Senger die Struktur von Insulin. Die Entwicklung von Methoden zur Reinigung des Hormons von anderen hormonellen Substanzen und Produkten des Insulinabbaus ermöglichte die Gewinnung von homogenem Insulin, dem sogenannten Einkomponenteninsulin.

In den frühen 70er Jahren gg. Die sowjetischen Wissenschaftler A. Yudaev und S. Shvachkin schlugen eine chemische Insulinsynthese vor, die Umsetzung dieser Synthese im industriellen Maßstab war jedoch teuer und unrentabel.

In der Zukunft verbesserte sich der Reinigungsgrad von Insulinen progressiv, wodurch die durch Insulinallergien, Nierenfunktionsstörungen, Sehstörungen und Immuninsulinresistenz verursachten Probleme reduziert wurden. Das wirksamste Hormon wurde für die Substitutionstherapie bei Diabetes mellitus benötigt - homologes Insulin, dh Humaninsulin.

In den 80er Jahren ermöglichten die Fortschritte in der Molekularbiologie die Synthese sowohl der menschlichen Insulinketten mit E. coli, die dann zu einem biologisch aktiven Hormonmolekül verbunden wurden, als auch rekombinantes Insulin am Institut für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften unter Verwendung genetisch veränderter E.coli-Stämme.

Die Verwendung der Affinitätschromatographie reduzierte den Gehalt an kontaminierenden Proteinen in der Zubereitung mit einem höheren Molekulargewicht als Insulin signifikant. Solche Proteine ​​umfassen Proinsulin und teilweise gespaltene Proinsuline, die die Produktion von Antiinsulin-Antikörpern induzieren können.

Die Verwendung von Humaninsulin von Anfang an minimiert das Auftreten allergischer Reaktionen. Humaninsulin wird schneller resorbiert und hat unabhängig von der Form des Arzneimittels eine kürzere Wirkungsdauer als tierisches Insulin. Menschliche Insuline sind weniger immunogen als Schweinefleisch, insbesondere Rinder- und Schweineinsuline.

1. Arten von Insulin

Insulinpräparate unterscheiden sich im Reinigungsgrad; Empfangsquelle (Rinder, Schweine, Mensch); Substanzen, die der Insulinlösung zugesetzt werden (Verlängerung ihrer Wirkung, Bakteriostatika usw.); Konzentration; pH-Wert; die Möglichkeit, ICD mit SDI zu mischen.

Insulinpräparate variieren je nach Quelle. Schweine- und Rinderinsulin unterscheidet sich vom Menschen in der Aminosäurezusammensetzung: Rinder in drei Aminosäuren und Schwein in einer. Es ist nicht überraschend, dass Nebenwirkungen bei der Behandlung mit Rinderinsulin viel häufiger auftreten als bei der Behandlung mit Schweine- oder Humaninsulin. Diese Reaktionen äußern sich in immunologischer Insulinresistenz, Insulinallergie, Lipodystrophie (Änderung des Unterhautfetts an der Injektionsstelle).

Trotz der offensichtlichen Nachteile von Rinderinsulin ist es in der Welt immer noch weit verbreitet. Immunologisch sind die Mängel von Rinderinsulin jedoch offensichtlich: Es wird auf keinen Fall empfohlen, es für Patienten mit neu diagnostiziertem Diabetes mellitus, schwangere Frauen oder für eine kurzfristige Insulintherapie, beispielsweise in der perioperativen Phase, zu verschreiben. Die negativen Eigenschaften von Rinderinsulin bleiben auch erhalten, wenn es in einer Mischung mit Schweinen angewendet wird. Daher sollten gemischte Insuline (Schweine + Rinder) nicht zur Behandlung dieser Kategorien von Patienten verwendet werden.

Humaninsulinpräparate für die chemische Struktur sind völlig identisch mit Humaninsulin.

Das Hauptproblem der Biosynthesemethode zur Gewinnung von Humaninsulin ist die vollständige Reinigung des Endprodukts von den kleinsten Verunreinigungen der verwendeten Mikroorganismen und ihrer Stoffwechselprodukte. Neue Methoden der Qualitätskontrolle stellen sicher, dass humane biosynthetische Insuline der oben genannten Hersteller frei von schädlichen Verunreinigungen sind. Ihr Reinigungsgrad und die Glukosesenkungseffizienz erfüllen somit die höchsten Anforderungen und sind nahezu gleich. Alle unerwünschten Nebenwirkungen, abhängig von den Verunreinigungen, enthalten diese Medikamente kein Insulin.

Derzeit werden drei Arten von Insulinen in der medizinischen Praxis verwendet:

- kurze Reichweite mit schnellem Wirkungseintritt;

- durchschnittliche Aktionsdauer;

- Langzeitwirkung mit langsamer Wirkung.

Tabelle 1. Eigenschaften kommerzieller Insulinpräparate

Kurzwirksames Insulin (ICD) - reguläres Insulin - ist ein kurzwirksames kristallines Zinkinsulin, das bei neutralem pH-Wert löslich ist und dessen Wirkung sich innerhalb von 15 Minuten nach subkutaner Verabreichung entwickelt und 5-7 Stunden anhält.

Das erste verlängerte Insulin (SDI) wurde in den späten 30er Jahren geschaffen, so dass Patienten seltener Injektionen vornehmen konnten als bei alleiniger Anwendung von ICD, wenn möglich, einmal täglich. Um die Wirkungsdauer zu verlängern, werden alle anderen Insulinpräparate modifiziert und bilden, wenn sie in neutralem Medium gelöst werden, eine Suspension. Sie enthalten Protamin in Phosphatpuffer - Protamin-Zink-Insulin und NPH (neutrales Protamin-Hagedorn) -NPH-Insulin oder verschiedene Konzentrationen von Zink in Acetatpuffer - Insulin ultralente, Tape, Sevile.

Insulinpräparate mittlerer Dauer enthalten Protamin, das ein Protein von durchschnittlich m ist. 4400, reich an Arginin und aus Regenbogenforellenmilz gewonnen. Für die Bildung des Komplexes ist ein Verhältnis von Protamin und Insulin von 1:10 erforderlich. nach subkutaner Verabreichung zerstören proteolytische Enzyme Protamin, wodurch Insulin absorbiert werden kann.

NPH-Insulin ändert das pharmakokinetische Profil von mit diesem gemischtem regulatorischem Insulin nicht. NPH-Insulin ist dem Insulinband als Bestandteil der durchschnittlichen Wirkdauer in therapeutischen Gemischen vorzuziehen, die reguläres Insulin enthalten.

Im Phosphatpuffer bilden alle Insuline leicht mit Zink Kristalle, aber nur Rinderinsulinkristalle sind ausreichend hydrophob, um eine langsame und stetige Freisetzung von Insulin bereitzustellen, die für ultralente Eigenschaften charakteristisch ist. Zinkkristalle von Schweineinsulin lösen sich schneller auf, die Wirkung kommt früher, die Wirkungsdauer ist kürzer. Daher gibt es kein ultralente Medikament, das nur Schweineinsulin enthält. Monokomponenten-Schweineinsulin wird unter dem Namen Insulinsuspension Insulin-neutral, Insulinisophan, Insulinaminochinurid hergestellt.

Insulinband ist eine Mischung aus 30% Insulin des Halbblatts (amorphes Insulin präzipitiert mit Zinkionen in Acetatpuffer, dessen Wirkung sich relativ schnell auflöst) mit 70% Insulin ultralente (schlecht lösliches kristallines Zinkinsulin, das einen verzögerten Beginn und eine längere Wirkung hat). Diese beiden Komponenten bieten eine Kombination mit relativ schneller Absorption und stabiler Langzeitwirkung, wodurch das Insulinband zu einem geeigneten therapeutischen Mittel wird.

2. Insulin bekommen

Humaninsulin kann auf vier Arten hergestellt werden:

1) vollständige chemische Synthese;

2) Extraktion aus der Bauchspeicheldrüse einer Person (beide Methoden sind wegen Ineffizienz nicht geeignet: ungenügende Entwicklung der ersten Methode und Mangel an Rohstoffen für die Massenproduktion nach der zweiten Methode);

3) durch ein semisynthetisches Verfahren unter Verwendung einer enzymchemischen Substitution an Position 30 der B-Kette der Aminosäure Alanin in Schweineinsulin mit Threonin;

4) Biosyntheseverfahren für die Gentechnik. Die letzten beiden Verfahren erlauben es, hochreines Humaninsulin zu erhalten.

Gegenwärtig wird menschliches Insulin hauptsächlich auf zwei Wegen erhalten: durch Modifizieren von Schweineinsulin durch ein synthetisch-enzymatisches Verfahren und durch ein gentechnisches Verfahren.

Insulin war das erste Protein, das für kommerzielle Zwecke unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie erhalten wurde. Es gibt zwei Hauptansätze zur Gewinnung von gentechnisch hergestelltem Humaninsulin.

Im ersten Fall produzieren getrennte (verschiedene Produzentenstämme) beide Ketten, gefolgt von der Faltung des Moleküls (Bildung von Disulfidbrücken) und der Trennung von Isoformen.

Im zweiten Schritt erfolgt die Herstellung in Form einer Vorstufe (Proinsulin), gefolgt von einer enzymatischen Spaltung mit Trypsin und Carboxypeptidase B zur aktiven Form des Hormons. Derzeit ist es am meisten bevorzugt, Insulin als Vorläufer zu erhalten, um den korrekten Verschluss von Disulfidbrücken zu gewährleisten (im Falle der getrennten Herstellung von Ketten werden aufeinanderfolgende Denaturierungszyklen, Trennung von Isoformen und Renaturierung durchgeführt).

Bei beiden Ansätzen ist es möglich, sowohl einzeln die Ausgangskomponenten (A- und B-Ketten oder Proinsulin) als auch als Teil von Hybridproteinen zu erhalten. Neben A- und B-Ketten oder Proinsulin können Hybridproteine ​​in der Zusammensetzung enthalten sein:

- Proteinträger, der den Transport des Hybridproteins im periplasmatischen Raum der Zelle oder des Kulturmediums bereitstellt;

- Affinitätskomponente, die die Auswahl eines Hybridproteins erheblich erleichtert.

Zur gleichen Zeit können beide Komponenten gleichzeitig in der Zusammensetzung des Hybridproteins vorhanden sein. Außerdem kann bei der Herstellung von Hybridproteinen das Prinzip der Multidimensionalität verwendet werden (dh es befinden sich mehrere Kopien des Zielpolypeptids im Hybridprotein), wodurch die Ausbeute des Zielprodukts signifikant gesteigert werden kann.

In Großbritannien wurden beide Humaninsulinketten unter Verwendung von E. coli synthetisiert, die dann an ein biologisch aktives Hormonmolekül gebunden wurden. Damit ein einzelliger Organismus Insulinmoleküle auf seinen Ribosomen synthetisieren kann, muss er mit dem erforderlichen Programm versorgt werden, dh, das Hormon-Gen wird eingeführt.

Holen Sie sich chemisch die Biosynthese-Vorstufe von Insulin oder zwei Gene, indem Sie die Biosynthese der Insulinketten A und B separat programmieren.

Die nächste Stufe ist der Einschluss des Gens für Insulinvorläufer (oder Kettengene getrennt) in das Genom von E. coli, einem unter Laborbedingungen gezüchteten speziellen Stamm von E. coli. Diese Aufgabe übernimmt die Gentechnik.

Das Plasmid wird durch das entsprechende Restriktionsenzym aus E. coli isoliert. Das synthetische Gen wird in ein Plasmid inseriert (Klonierung mit dem funktionell aktiven C-terminalen Teil von β-Galactosidase E. coli). Infolgedessen erhält E. coli die Fähigkeit, eine Proteinkette bestehend aus Galactosidase und Insulin zu synthetisieren. Synthetisierte Polypeptide werden chemisch vom Enzym abgespalten und anschließend gereinigt. In Bakterien werden pro Bakterienzelle etwa 100.000 Insulinmoleküle synthetisiert.

Die Art der von E. coli produzierten Hormonsubstanz wird dadurch bestimmt, welches Gen in das Genom des einzelligen Organismus eingefügt wird. Wenn das Insulinvorläufergen kloniert wird, synthetisiert das Bakterium den Insulinvorläufer, der dann einer Restriktionsenzymbehandlung unterworfen wird, um die Präität mit der Isolierung des C-Peptids zu entfernen, was zu biologisch aktivem Insulin führt.

Um gereinigtes Humaninsulin zu erhalten, wird das aus Biomasse isolierte Hybridprotein einer chemisch-enzymatischen Transformation und der entsprechenden chromatographischen Reinigung (primär, geldurchdringend, Anionenaustausch) unterzogen.

Rekombinantes Insulin wurde am Institut für RAS unter Verwendung genetisch veränderter E. coli-Stämme erhalten. Ein Vorläufer, ein Hybridprotein, das in einer Menge von 40% des gesamten zellulären Proteins exprimiert wird, das Präproinsulin enthält, wird aus der gezüchteten Biomasse freigesetzt. Seine Umwandlung in Insulin in vitro erfolgt in der gleichen Reihenfolge wie in vivo - das führende Polypeptid wird gespalten, Präproinsulin wird durch oxidative Sulfitolysestufen in Insulin umgewandelt, gefolgt vom reduktiven Schließen von drei Disulfidbindungen und der enzymatischen Isolierung der C-Peptidbindung. Nach einer Reihe von chromatographischen Reinigungen, einschließlich Ionenaustausch, Gel und HPLC, wird Humaninsulin von hoher Reinheit und natürlicher Aktivität erhalten.

Ein Stamm mit einer in ein Plasmid eingebetteten Nukleotidsequenz, die ein Fusionsprotein exprimiert, kann verwendet werden, der aus linearem Proinsulin und dem an sein N-Terminus gebundenem Staphylococcus aureus-Proteinfragment A besteht.

Durch die Kultivierung der gesättigten Biomasse von Zellen des rekombinanten Stammes wird der Beginn der Produktion des Hybridproteins sichergestellt, dessen Isolierung und sequentielle Transformation im Röhrchen zu Insulin führt.

Ein anderer Weg ist auch möglich: In einem bakteriellen Expressionssystem stellt sich ein rekombinantes Fusionsprotein dar, das aus humanem Proinsulin und einem über einen Methioninrest daran gebundenen Polyhistidin-Schwanz besteht. Es wird mittels Chelat-Chromatographie an Ni-Agarose-Säulen aus Einschlusskörpern isoliert und mit Bromcyan digeriert.

Das isolierte Protein ist S-sulfoniert. Die Kartierung und massenspektrometrische Analyse des erhaltenen Proinsulins, gereinigt durch Ionenaustauschchromatographie an Anionenaustauschern und RP (Umkehrphasen) HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie), zeigt das Vorhandensein von Disulfidbrücken, die den Disulfidbrücken von nativem humanem Proinsulin entsprechen.

In letzter Zeit wurde besonderes Augenmerk auf die Vereinfachung des Verfahrens zur Herstellung von rekombinantem Insulin durch gentechnische Verfahren gelegt. Beispielsweise ist es möglich, ein Fusionsprotein zu erhalten, das aus dem Leaderpeptid von Interleukin 2 besteht, das über einen Lysinrest an den N-Terminus von Proinsulin gebunden ist. Das Protein wird in Einschlusskörpern effektiv exprimiert und lokalisiert. Nach der Isolierung wird das Protein mit Trypsin gespalten, um Insulin und C-Peptid herzustellen.

Das resultierende Insulin und das C-Peptid wurden durch RP-HPLC gereinigt. Bei der Herstellung von Fusionsstrukturen ist das Massenverhältnis des Trägerproteins zum Zielpolypeptid sehr signifikant. C-Peptide werden nach dem Head-Tail-Prinzip unter Verwendung von Aminosäure-Spacern verbunden, die die Sfi I-Restriktionsstelle und zwei Argininreste am Anfang und am Ende des Spacers tragen, um das Protein anschließend mit Trypsin zu spalten. HPLC-Spaltprodukte zeigen, dass die Spaltung des C-Peptids quantitativ ist, und dies macht es möglich, das Verfahren multimerer synthetischer Gene zu verwenden, um Zielpolypeptide im industriellen Maßstab zu erhalten.

Diabetes mellitus ist eine chronische Krankheit, die durch absoluten oder relativen Insulinmangel verursacht wird. Es ist durch eine tiefe Stoffwechselstörung von Kohlenhydraten mit Hyperglykämie und Glukosurie sowie durch andere Stoffwechselstörungen infolge einer Reihe genetischer und äußerer Faktoren gekennzeichnet.

Insulin dient bis heute als radikaler und in den meisten Fällen der einzige Weg, um das Leben und die Behinderung von Diabetikern aufrechtzuerhalten. Vor der Aufnahme und Einführung von Insulin in die Klinik 1922-1923. Patienten mit Diabetes mellitus Typ I warteten ein bis zwei Jahre nach Ausbruch der Erkrankung trotz tödlicher Ernährung auf ein tödliches Ergebnis. Patienten mit Diabetes mellitus Typ I benötigen eine lebenslange Substitutionsbehandlung mit Insulin. Ein Abbruch aus verschiedenen Gründen für die regelmäßige Einführung von Insulin führt zu einer raschen Entwicklung von Komplikationen und dem unmittelbar bevorstehenden Tod des Patienten.

Derzeit liegt Diabetes hinsichtlich der Prävalenz nach kardiovaskulären und onkologischen Erkrankungen an dritter Stelle. Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) beträgt die Prävalenz von Diabetes bei der erwachsenen Bevölkerung in den meisten Regionen der Welt 2 bis 5%, und es besteht die Tendenz, die Anzahl der Patienten fast alle 15 Jahre zu erhöhen. Trotz der offensichtlichen Fortschritte auf dem Gebiet der Gesundheitsfürsorge steigt die Zahl der Insulin-abhängigen Patienten von Jahr zu Jahr. Allein in Russland sind es derzeit etwa 2 Millionen Menschen.

Die Herstellung von Medikamenten für inländisches menschliches genetisches Insulin eröffnet neue Möglichkeiten, um viele Probleme der Diabetologie in Russland zu lösen, um Millionen von Menschen mit Diabetes das Leben zu retten.

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Vorschriften für die Herstellung einer genetisch modifizierten Insuling-Methode

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Staatliche Bildungseinrichtung

höhere berufliche Bildung

Kursk State Medical University

Bundesamt für Gesundheit und soziale Entwicklung

Abteilung für pharmazeutische Technologie

gentechnisch modifiziertes Insulin mittels rDNA-Biotechnologie zu erhalten

5. Jahr Schüler 5 Gruppen

Doktor, Oberlehrerin Maravina I.N.

Abschnitt I. Merkmale des Endprodukts 3

Abschnitt II. Merkmale der Rohstoffe 5

Abschnitt III. Chemisches Produktionsschema 6

Abschnitt IV. Technologisches Produktionsschema 7

Abschnitt V. Produktionsablaufplan und Spezifikation

Abschnitt VI. Prozesserklärung 10

Abschnitt VII. Analysemethoden 14

Abschnitt VIII. Sicherheit, Brandschutz,

Industrielle Hygiene 16

Abschnitt IX. Liste der Fertigungsanweisungen 17

Abschnitt I. Eigenschaften des Endprodukts

Trockenes Insulin-Biomasse

Beschreibung Insulinlösungen sind klare, farblose oder leicht gelbliche saure Flüssigkeiten (pH 2,0–3,5), die durch Verdünnen von kristallinem Insulin in mit Salzsäure angesäuertem Wasser unter Zusatz von Glycerin und 0,25–0,30% Phenol- oder Tricresollösung hergestellt werden für die Konservenindustrie

Hypoglykämikum, kurz wirkendes Insulin. Interagiert mit einem spezifischen Rezeptor in der äußeren Membran von Zellen und bildet einen Insulinrezeptorkomplex. Durch die Aktivierung der cAMP-Biosynthese in Fettzellen und Leberzellen oder direkt durchdrungene Muskelzellen stimuliert der Insulinrezeptorkomplex intrazelluläre Prozesse, einschließlich Synthese einer Reihe von Schlüsselenzymen (Hexokinase, Pyruvatkinase, Glykogen-Synthetase usw.). Die Abnahme des Blutzuckers beruht auf einer Erhöhung seines intrazellulären Transports, einer erhöhten Absorption und Absorption durch Gewebe, Stimulation der Lipogenese, Glykogenogenese, Proteinsynthese, einer Abnahme der Glukoseproduktionsrate durch die Leber usw. Die Wirkungsdauer von Insulinpräparaten beruht hauptsächlich auf der Resorption Faktoren (von einer Dosis, einer Methode und einer Injektionsstelle). Nach p / bis zum Beginn der Wirkung - nach 0,5 h die maximale Wirkung - nach 1-3 Stunden die Wirkdauer - 8 Stunden.

Diabetes mellitus Typ 1 (insulinabhängig). Typ-2-Diabetes mellitus (nicht insulinabhängig): Resistenzstadium gegen orale hypoglykämische Mittel, partielle Resistenz gegen diese Arzneimittel (während der Kombinationstherapie), interkurrente Erkrankungen, Schwangerschaft.

Zu Beginn der Therapie - Sehstörung, Schwellung der Gliedmaßen. Mit der Einführung von zu hohen Insulindosen oder einer Verletzung der Diät (Überspringen von Mahlzeiten) sowie übermäßiger Bewegung, Hypoglykämie (kalter Schweiß, blasse Haut, Nervosität, Tremor, Angstzustände, übermäßige Müdigkeit oder Schwäche, Desorientierung, Schwindel, Kopfschmerzen, ausgeprägtes Hungergefühl, vorübergehende Sehstörung, Übelkeit, Tachykardie, in schweren Fällen - Bewusstlosigkeit, Koma. Systemische allergische Reaktionen: vermehrtes Schwitzen, Erbrechen, Atemnot, Herzklopfen, Schwindel.

Haltbarkeit - 1 Jahr ab Herstellungsdatum.

Abschnitt II. Eigenschaften der Rohstoffe

Ketten von Genen, die für die Synthese der Ketten A und B kodieren

Chemisch synthetisiert

Kultur muss rein sein

Vierlagige Papiertüten

Stoffe von Baumwollband

Abschnitt III. Chemisches Produktionsschema

Chemische Umwandlungen bei der Produktion von gentechnisch verändertem Insulin fehlen.

Abschnitt IV. Technologisches Schema für die Insulinproduktion

Vorbereitung der Räumlichkeiten und Ausrüstung

Sanitärverarbeitende Produktion

Vorbereitung der technologischen Kleidung

Synthese der Ketten A und B

Die Einführung von Genen in das Plasmid

Einführung von r-DNA in die permissive Zelle

Nährstoffvorbereitung

Kultivierungssuspensionskultur

Insulinmolekül bekommen

Nach FS-Indikatoren

Instrumentelles Produktionsschema und Ausrüstungsspezifikation

1 - Chemischer Reaktor

2 - Die Einführung von Genen in das Plasmid

4 - Kontinuierliche Sterilisationseinheit

5 - Industrieller Bioreaktor

6 - Auswahl der Ketten

7 - Chromatographische Installation

8 - Insulinmolekül bekommen

9 - Gefriertrockner

10 - Analysetabelle

Abschnitt VI. Prozessbeschreibung

BP 1. Wasseraufbereitung

Membrandestillierapparate wurden entwickelt, um entsalztes Wasser zu erhalten, das den Anforderungen von GOST 6709-97 "Destilliertes Wasser" entspricht. Produktivität der Destilliergeräte - von 3 bis 15 l / h (Laborinstallationen in einem wirtschaftlichen Komplettsatz) und auch von 5-30 l / h (Laborinstallationen). Der Filtrationsprozess umfasst die folgenden Stufen: Vorbehandlung von Aktivkohle, Membranfiltration und Entionisierung von Wasser mit Ionenaustauschern. Der Vorfilter entfernt suspendierte Partikel, Chlor, hochmolekulare organische Stoffe und Schwermetallionen aus dem Leitungswasser. Die Membranfiltration basiert auf dem Phänomen der Umkehrosmose, bei dem Wasser beim Durchlaufen einer semipermeablen Membran von darin gelösten Salzen, niedermolekularen organischen Verunreinigungen sowie Bakterien und Mikroorganismen gereinigt wird. Auf dem Filter mit Ionenaustauscherharzen erfolgt eine vollständige Reinigung des Filtrats von gelösten Salzen.

BP 2. Sanitäre Verarbeitung der Produktion.

BP 2.1. Folgende Voraussetzungen werden bei der Herstellung steriler Darreichungsformen vor Ort gestellt:

Muss in tadelloser Sauberkeit aufbewahrt werden und muss täglich sowie regelmäßig gereinigt und regelmäßig repariert werden.

Kann zur Luftdesinfektion mit stationären oder tragbaren Strahlern UV-Strahlung ausgesetzt werden;

Müssen Beleuchtung, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Belüftung haben, die die Qualität der Endprodukte nicht direkt oder indirekt beeinträchtigen;

Muss das für die Durchführung des Produktionsprozesses erforderliche Minimum an Ausrüstung und Möbeln enthalten;

Die Verbindung zwischen Wänden, Boden und Decke muss eine abgerundete Form haben.

In den Räumlichkeiten der Reinheitsklassen I und II sollte es keine offenen Kommunikationskanäle geben.

Räumlichkeiten höherer Reinheit sollten sich in einem Raum niedriger Reinheit befinden. Der Zugang von Personal und Rohstoffen zu einem Reinraum erfolgt nur über Luftdurchgänge, die mit steriler Luft nach dem "Top-Down" -Verfahren versorgt werden;

Die Übergabe des fertigen Produkts muss mit einem Förderer erfolgen, der durch die Wände verläuft.

BP 2.2. Vorbereitung der Ausrüstung

Anforderungen an die Vorbereitung der Ausrüstung:

Das Gerät muss so konstruiert und aufgestellt sein, dass Betrieb, Wartung und Reparaturen außerhalb der „sauberen“ Räume durchgeführt werden können.

Geräte, die zum Arbeiten unter aseptischen Bedingungen verwendet werden, müssen über Aufzeichnungsgeräte zur Überwachung von Prozessparametern und das Vorhandensein von Alarmgeräten für deren Fehlfunktion verfügen.

Das Gerät muss gereinigt, desinfiziert und gegebenenfalls sterilisiert werden.

Die Ausrüstung muss auf mikrobiologische Reinheit überwacht werden.

Die Arbeitsfläche des Geräts sollte glatt sein und aus ungiftigem und nicht korrosivem Material bestehen.

BP 2.3. Schulung der Mitarbeiter

Anforderungen an das Personal:

Das Personal muss über ein Mindestmaß an Hygiene-, Hygiene- und GMP-Regeln verfügen.

Mitarbeiter mit Infektionskrankheiten, offenen Wunden auf der Haut und Träger pathogener Mikroflora dürfen nicht arbeiten.

Es ist verboten zu sprechen, zu essen und sich schnell am Arbeitsplatz zu bewegen.

Beachten Sie die persönliche Hygiene streng, entfernen Sie Kosmetika aus dem Gesicht und entfernen Sie den Schmuck, bevor Sie den "sauberen" Raum betreten.

Duschen Sie, waschen und reinigen Sie Ihre Hände mit Desinfektionsmitteln, ziehen Sie sterile technische Kleidung und Schuhe an.

BP 3. Synthese der Ketten A und B.

Die Synthese von Ketten erfolgt auf chemischem Wege. Kette A enthält 21 Aminosäurereste, Kette B - 30 Reste

BP 4. Die Einführung von Genen in das Plasmid.

Damit das Plasmid ein fremdes Gen annehmen kann, wird seine Kette mit Restriktionsenzymen geschnitten. Zur Verknüpfung der Gene, die für die Synthese der Ketten A und B kodieren, werden Oligosaccharidreste unterschiedlicher Länge verwendet - Linker und Adaptoren. Wenn das Molekül geschlossen ist, können Sie es in eine permissive Zelle eingeben.

BP 5. Die Einführung von r-DNA in die permissive Zelle.

Die Einführung von p = DNA in eine E. coli-Zelle erfolgt durch Mikroinjektion: Ein Plasmid, das Vektor-DNA enthält, wird mit einer speziellen ultradünnen Glasnadel in eine E. coli-Zelle injiziert.

TP 6. Zubereitung eines Nährmediums

Das Hauptnährstoffmedium für die Kultivierung der E. coli-Kultur ist laut Miller Brühe. Zutaten: Caseinhydrolysat, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Agar-Agar. Der endgültige pH-Wert (bei 25 ° C) beträgt 7,0 ± 0,2. Auch Hottingers Bouillon wird verwendet. Zutaten: Hottinger-Hydrolysat, Natriumchlorid, destilliertes Wasser.

Die Sterilisation des Nährmediums wird in einer Maschine zur kontinuierlichen Sterilisation durchgeführt - ONS. Das Nährmedium durchläuft nacheinander den Heizabschnitt, den Halteabschnitt und den Kühlabschnitt.

TP 7. Kultivierung der Suspensionskultur

Die Kultivierung der Biokultur wird in Bioreaktoren durchgeführt, wobei die Suspensionskultur aufgrund der Luftzufuhr in den Bioreaktor gemischt wird. Das Verfahren wird im halbperiodischen Modus durchgeführt, wenn dem Bioreator ständig eine bestimmte Menge frisches Nährmedium zugesetzt wird und gleichzeitig das gleiche Volumen der Zellsuspension entnommen wird.

TP 8. Isolierung der Gewebekultur.

Die Trennung der Gewebekultur vom Nährmedium erfolgt durch die Sedimentationsmethode (Sedimentation) in Sedimenten, eine tiefere Trennung erfolgt durch Filtern einer schonenden Methode, um die Integrität der Kulturzellen zu erhalten.

Das Insulin wird durch Chromatographiemethoden gereinigt: Frontal, Gelpermeation, Anionenaustausch. Zur Reinigung von Insulin und seinen Derivaten auf Sorbentien mit starken Kationenaustauschereigenschaften (zum Beispiel SP-Sepharose FF) können Puffersysteme auf Basis von Ammoniumacetat mit einem geringen Harnstoffgehalt (bis zu 2 M oder weniger) verwendet werden.

TP 10. Insulinmolekül bekommen

Ausgewählte und gereinigte Ketten werden gefaltet und oxidiert, was die Bildung geeigneter Disulfidbrücken gewährleistet.

Die Trocknung des Produktes erfolgt in einem Gefriertrockner.

TP 12. Bewertung der Qualität des Endprodukts.

Aussehen (wie beschrieben), Aktivität (biologische Methode).

UMO 13. Verpackung, Etikettierung, Versand.

Die Insulinaktivität wird in Aktionseinheiten (ED) oder in internationalen Aktionseinheiten (IU - Russisch oder IU - Englisch oder UI - Französisch) gemessen. 1 Einheit entspricht der Aktivität von 1/24 mg (41,66 µg) kristallinen Insulins.

Im Jahr 1922 schlug Frederick Banting vor, dass die Insulinaktionseinheit als die Anzahl der Kubikzentimeter Pankreasextrakt betrachtet werden sollte, die ein gesundes Kaninchen innerhalb von 2 bis 4 Stunden zu einer Hypoglykämie mit einem SC-Spiegel von 2,5 mmol / L brachte. Etwas später im selben Jahr schlug das gleiche Team eine "Maus" -Einheit vor - die Insulinmenge, die erforderlich war, um die Hälfte der experimentellen Gruppe von Mäusen zu Krämpfen zu bringen (die Forscher handelten hier zunächst in Analogie zur LD50).

Im folgenden Jahr nahm das Internationale Komitee für Normung die Definition der Insulinaktionseinheit an: "Die Insulinmenge, die erforderlich ist, um den Blutzuckerspiegel auf das Niveau zu senken, bei dem die Anfälle bei Kaninchen mit einem Gewicht von 2 kg beginnen, die 24 Stunden lang nicht gefüttert worden sind." Diese Einheit wurde zu Ehren der Toronto-Gruppe von Banting und Best als Insulin-Aktionseinheit von Toronto bezeichnet.

1925 wurde der erste internationale Standard eingeführt, der feststellte, dass eine Einheit Insulinwirkung 1/8 mg kristallinen Insulins entspricht.

Aufgrund des großen Fortschritts bei der Insulinreinigung und der Unbequemlichkeit der Verwendung einer so großen Einheit im Jahr 1936 genehmigte das Völkerbundkomitee einen neuen internationalen Standard für die Insulinwirkung, der die Einheit mit 1/22 mg kristallinem Insulin gleichsetzte. 1952 wurde der Standard erneut geändert und 1 Einheit wurde mit 1 / 24,5 mg kristallinem Insulin gleichgesetzt, und 1958 erschien schließlich der vierte Standard (1 U entspricht 1/24 mg kristallinem Insulin). Die WHO hat 1982 die jüngsten Anpassungen des Standards vorgenommen, die sich nicht auf die Definition der Einheit auswirkten, sondern nur Änderungen im Zusammenhang mit der Entstehung von gentechnisch verändertem Humaninsulin betrafen.

Abschnitt VIII. Sicherheit, Brandschutz und

Jeder Arbeiter und Ingenieur muss nach Erhalt der Arbeit eine Grundschulung erhalten. Das primäre Briefing wird vom Vorarbeiter oder Meister gemäß dem folgenden Programm durchgeführt:

Die wichtigsten Bestimmungen der Gesetzgebung zu Arbeitsschutz, Sicherheit und Hygiene in der Industrie;

Zweck und Verfahren für die Verwendung von Spezialkleidung und persönlicher Schutzausrüstung;

Pflichten am Arbeitsplatz;

Anforderungen an die ordnungsgemäße Organisation und Instandhaltung des Arbeitsplatzes;

Allgemeine elektrische Sicherheitsregeln, Wert der Belüftung und Regeln für die Verwendung von Belüftungssystemen;

Kenntnis des technologischen Prozesses, der Geräteausstattung und aller gefährlichen Objekte.

Alle elektrischen Geräte müssen den Anforderungen der "Regeln für den Betrieb elektrischer Geräte" entsprechen. Elektrische Geräte müssen geerdet sein. Alle Produktions- und Betriebsräume, Installationen und Anlagen sollten mit Feuerlöschgeräten und Feuerlöschgeräten ausgestattet sein.

Die Zulassung von unbefugten Personen in den Laden ist untersagt.

Abschnitt IX. Liste der Fertigungsanweisungen

Arbeitsanweisungen für die sanitäre Behandlung von Räumlichkeiten.

Anweisungen für Sicherheit, industrielle Hygiene und Brandschutz.

Anweisungen zur Vorbereitung, Lieferung und Erhalt der Reparatur der Ausrüstung.

Anweisungen zum Erhalt von Roh- und Hilfsstoffen;

Plan zur Beseitigung von Unfällen

Anweisungen zur Regeneration der Lösung.

Arbeitsanweisungen für den Betreiber zum Waschen, Trocknen und Sterilisieren von Flaschen.

Anweisungen für Mechaniker zur Reparatur und Wartung von Rohrleitungen.

Insulinproduktionstechnologie

Insulin.docx

Kapitel 1. Literaturübersicht

1.3. Spritzen, Kugelschreiber und Insulinspender

1.4 Insulininjektionstechnik …………………………………...

1.5.Faktoren, die die Insulinaufnahme und -wirkung beeinflussen.........

1.6. Komplikationen der Insulintherapie …………………………………..

1.7. Insulinverpackung

1.8. Insulinlagerung.

1,9. Moderne Wege zur Verbesserung der Insulintherapie.....

Kapitel 2. Experimenteller Teil

Insulin (aus dem Lateinischen Insula - die Insel) - ein Peptidhormon, wird in den Betazellen der Langerhans-Inseln des Pankreas gebildet. Es hat eine vielfältige Wirkung auf den Stoffwechsel in fast allen Geweben.

Die Hauptfunktion von Insulin besteht darin, die Permeabilität von Zellmembranen für Glucosemoleküle sicherzustellen. In vereinfachter Form können wir sagen, dass nicht nur Kohlenhydrate, sondern auch alle Nährstoffe letztendlich in Glukose gespalten werden, die zur Synthese anderer kohlenstoffhaltiger Moleküle verwendet wird und der einzige Brennstoff für zelluläre Kraftwerke ist - Mitochondrien. Ohne Insulin sinkt die Durchlässigkeit der Zellmembran für Glukose um das 20fache, und die Zellen verhungern, und der im Blut gelöste überschüssige Zucker vergiftet den Körper.

Die Insulinsekretionsstörung aufgrund der Zerstörung der Betazellen - absoluter Insulinmangel - ist ein Schlüsselelement bei der Pathogenese des Typ-1-Diabetes mellitus. Die Verletzung der Wirkung von Insulin auf das Gewebe - relativer Insulinmangel - spielt bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes eine wichtige Rolle.

Die Zahl der Diabetiker weltweit beträgt 120 Millionen (2,5% der Bevölkerung). Alle 10-15 Jahre verdoppelt sich die Anzahl der Patienten. Nach Angaben des International Diabetes Institute (Australien) wird es weltweit bis zu 220 Millionen Patienten geben. In der Ukraine gibt es etwa eine Million Patienten, von denen 10-15% am schwersten insulinabhängigen Diabetes (Typ I) leiden. Tatsächlich ist die Anzahl der Patienten aufgrund versteckter, nicht diagnostizierter Formen 2-3 Mal so groß.

Die Geschichte der Insulinentdeckung ist mit dem Namen des russischen Arztes I.M. Sobolev (zweite Hälfte des 19. Jahrhunderts), der bewies, dass der Zuckerspiegel im menschlichen Blut durch ein spezielles Hormon der Bauchspeicheldrüse reguliert wird.

Im Jahr 1922 wurde Insulin, das aus der Bauchspeicheldrüse eines Tieres isoliert worden war, erstmals einem zehnjährigen Diabetiker verabreicht. Das Ergebnis übertraf alle Erwartungen und ein Jahr später veröffentlichte die amerikanische Firma Eli Lilly das erste tierische Insulinpräparat.

Nachdem in den nächsten Jahren die erste industrielle Insulinsubstanz erhalten worden war, wurde ein großer Weg ihrer Isolierung und Reinigung abgedeckt. Infolgedessen wurde das Hormon für Patienten mit Typ-1-Diabetes verfügbar.

Im Jahr 1935 optimierte der dänische Forscher Hagedorn die Wirkung von Insulin im Körper, indem er ein verlängertes Medikament vorschlug.

Die ersten Insulinkristalle wurden 1952 erhalten, und 1954 entschlüsselte der englische Biochemiker G.Senger die Struktur von Insulin. Die Entwicklung von Methoden zur Reinigung des Hormons von anderen hormonellen Substanzen und Produkten des Insulinabbaus ermöglichte die Gewinnung von homogenem Insulin, dem sogenannten Einkomponenteninsulin.

In den frühen 70er Jahren gg. Die sowjetischen Wissenschaftler A. Yudaev und S. Shvachkin schlugen eine chemische Insulinsynthese vor, die Umsetzung dieser Synthese im industriellen Maßstab war jedoch teuer und unrentabel.

In der Zukunft verbesserte sich der Reinigungsgrad von Insulinen progressiv, wodurch die durch Insulinallergien, Nierenfunktionsstörungen, Sehstörungen und Immuninsulinresistenz verursachten Probleme reduziert wurden. Das wirksamste Hormon wurde für die Substitutionstherapie bei Diabetes mellitus benötigt - homologes Insulin, dh Humaninsulin.

In den 80er Jahren ermöglichten die Fortschritte in der Molekularbiologie die Synthese sowohl der menschlichen Insulinketten mit E. coli, die dann zu einem biologisch aktiven Hormonmolekül verbunden wurden, als auch rekombinantes Insulin am Institut für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften unter Verwendung genetisch veränderter E.coli-Stämme.

Das Ziel meiner Arbeit: Die Untersuchung der auf unserem Markt präsentierten Insulinpräparate, ihre Vor- und Nachteile.

Aufgaben: Berücksichtigung des Prozesses zur Gewinnung von Insulin in der industriellen Produktion.

Kapitel 1. Literaturübersicht

1.1 Insulin bekommen

Humaninsulin kann auf vier Arten hergestellt werden:

1) vollständige chemische Synthese;

2) Extraktion aus der Bauchspeicheldrüse einer Person (beide Methoden sind wegen Ineffizienz nicht geeignet: ungenügende Entwicklung der ersten Methode und Mangel an Rohstoffen für die Massenproduktion nach der zweiten Methode);

3) durch ein semisynthetisches Verfahren unter Verwendung einer enzymchemischen Substitution an Position 30 der B-Kette der Aminosäure Alanin in Schweineinsulin mit Threonin;

4) Biosyntheseverfahren für die Gentechnik. Die letzten beiden Verfahren erlauben es, hochreines Humaninsulin zu erhalten.

Erwägen Sie die Insulinbiosynthese hinsichtlich der Vorteile dieser Methode.

Also, die Vorteile der Insulingewinnung biosynthetisch.

Vor der Einführung des Insulinherstellungsverfahrens mit rekombinanten Mikroorganismen in der Industrie gab es nur einen Weg, Insulin zu gewinnen - aus den Pankreasdrüsen von Rindern und Schweinen. Insulin, das aus dem Pankreas von Rindern stammt, unterscheidet sich von Humaninsulin durch 3 Aminosäurereste, und aus Schweinedrüse gewonnenes Insulin ist nur ein Aminosäurerest, das heißt, es ist näher an Humaninsulin. Mit der Einführung von Proteinen, die sich in der Struktur von menschlichen Proteinen unterscheiden, können jedoch auch bei einer so geringen Expression allergische Reaktionen auftreten. Solches Insulin als Fremdprotein kann auch durch die resultierenden Antikörper im Blut inaktiviert werden.

Um 1 Kilogramm Insulin zu erhalten, sind zusätzlich 35.000 Schweine erforderlich (wenn bekannt ist, dass der jährliche Insulinbedarf 1 Tonne des Arzneimittels beträgt). Andererseits kann die gleiche Insulinmenge durch Biosynthese in einem kubischen Fermenter unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus Escherichia coli biosynthetisch erhalten werden.

Die Biosynthesemethode zur Gewinnung von Insulin wurde Anfang der 80er Jahre angewendet

Lassen Sie uns auf das Schema zur Herstellung von rekombinantem Insulin eingehen (Eli Lili-Eli-Lilly, Vereinigte Staaten von Amerika):

Stadium 1. Durch chemische Synthese wurden Nukleotidsequenzen erzeugt, die für die Bildung von A- und B-Ketten kodieren, d. H. Synthetische Gene wurden gebildet.

2. Etappe Jedes der synthetischen Gene wird in ein Plasmid eingeführt (ein Gen, das den Strang A synthetisiert, wird in ein Plasmid eingeführt, und ein Gen, das den Strang B synthetisiert, wird in das andere Plasmid eingeführt).

3. Stufe Geben Sie das Gen ein, das für die Bildung des Enzyms Betagalactosidase kodiert. Dieses Gen ist in jedem Plasmid enthalten, um eine kräftige Replikation von Plasmiden zu erreichen.

4. Stufe. Plasmide werden in Escherichia coli-Zellen eingeführt - Escherichia coli und zwei Erzeugerkulturen werden erhalten, eine Kultur synthetisiert die A-Kette, die zweite B-Kette.

5. Stufe. Zwei Kulturen in einen Fermenter geben. Am Mittwoch fügen Sie Galactose hinzu, die die Bildung des Enzyms Betagalactosidase induziert. In diesem Fall replizieren sich Plasmide aktiv und bilden viele Kopien von Plasmiden und damit viele Gene, die die A- und B-Ketten synthetisieren.

6. Stufe Die Zellen lysieren, sekretieren die A- und B-Ketten, die mit Betagalactosidase assoziiert sind. All dies wird mit Bromcyan behandelt und die A- und B-Ketten werden von der Beta-Galactosidase abgespalten. Dann weitere Reinigung und Auswahl der A- und B-Ketten vornehmen.

7. Stufe. Cysteinreste werden oxidiert, gebunden und Insulin hergestellt.

Auf diesem Weg gewonnenes Insulin ist in seiner Struktur menschliches Insulin, das von Beginn der Therapie an das Auftreten allergischer Reaktionen minimiert.

Um gereinigtes Humaninsulin zu erhalten, wird das aus Biomasse isolierte Hybridprotein einer chemisch-enzymatischen Transformation und einer geeigneten chromatographischen Reinigung (frontal, geldurchdringend, Anionenaustausch) unterzogen.

Ein rekombinantes Insulin wurde am Institut der Russischen Akademie der Wissenschaften unter Verwendung von gentechnisch hergestellten E. coli-Stämmen gewonnen, wobei die Methode in der Synthese seines biologischen Vorläufers von Proinsulin besteht, wodurch die getrennte Synthese der Insulin A- und B-Ketten nicht möglich ist. Zur Herstellung des Pro-Insulin-Teils des Moleküls in E. coli. Das Plasmid wird eingeführt (es wird durch Insertion von natürlicher oder fremder DNA erhalten - so wird ein rekombinantes RNA-Molekül erhalten). Das Plasmid sorgt für die Synthese von rekombinantem Protein, bei dem es sich um eine Leadersequenz und ein Fragment des Proteins handelt, sowie um humanes Proinsulin mit einem Methioninrest (Aminosäure) zwischen ihnen. Der Pro-Insulin-Teil des Moleküls wird durch Behandlung mit Bromcyan in Essigsäure getrennt (die Spaltung erfolgt selektiv - durch den Methioninrest). Die Mischung (Proinsulinteil und Leader-Sequenz) wird durch Chromatographie getrennt. In der nächsten Stufe wird in der resultierenden Sequenz von Proinsulin die korrekte gegenseitige Anordnung der Ketten A und B durchgeführt, die vom zentralen Teil - Peptid C durchgeführt wird. In der nächsten Stufe wird das bindende C-Peptid durch eine enzymatische Methode isoliert. Nach einer Reihe von chromatographischen Reinigungen, einschließlich Ionenaustausch, Gel und HPLC, erhalte ich hochreines Humaninsulin und natürliche Aktivität.

Die Qualitätskontrolle von gentechnisch hergestelltem Insulin beinhaltet die Kontrolle zusätzlicher Indikatoren, die die Stabilität des rekombinanten Stammes und Plasmids, das Fehlen von fremdem genetischem Material in der Zubereitung, die Identität des exprimierten Gens usw. kennzeichnen.

1.2 Insulinpräparate

Insulinpräparate variieren je nach Quelle. Schweine- und Rinderinsulin unterscheidet sich vom Menschen in der Aminosäurezusammensetzung: Rinder in drei Aminosäuren und Schwein in einer. Es ist nicht überraschend, dass Nebenwirkungen bei der Behandlung mit Rinderinsulin viel häufiger auftreten als bei der Behandlung mit Schweine- oder Humaninsulin. Diese Reaktionen äußern sich in immunologischer Insulinresistenz, Insulinallergie, Lipodystrophie (Änderung des Unterhautfetts an der Injektionsstelle).

Trotz der offensichtlichen Nachteile von Rinderinsulin ist es in der Welt immer noch weit verbreitet. Immunologisch sind die Mängel von Rinderinsulin jedoch offensichtlich: Es wird auf keinen Fall empfohlen, es für Patienten mit neu diagnostiziertem Diabetes mellitus, schwangere Frauen oder für eine kurzfristige Insulintherapie, beispielsweise in der perioperativen Phase, zu verschreiben. Die negativen Eigenschaften von Rinderinsulin bleiben auch erhalten, wenn es in einer Mischung mit Schweinen angewendet wird. Daher sollten gemischte Insuline (Schweine + Rinder) nicht zur Behandlung dieser Kategorien von Patienten verwendet werden.

Humaninsulinpräparate für die chemische Struktur sind völlig identisch mit Humaninsulin.

Das Hauptproblem der Biosynthesemethode zur Gewinnung von Humaninsulin ist die vollständige Reinigung des Endprodukts von den kleinsten Verunreinigungen der verwendeten Mikroorganismen und ihrer Stoffwechselprodukte. Neue Methoden der Qualitätskontrolle stellen sicher, dass humane biosynthetische Insuline der oben genannten Hersteller frei von schädlichen Verunreinigungen sind. Ihr Reinigungsgrad und die Glukosesenkungseffizienz erfüllen somit die höchsten Anforderungen und sind nahezu gleich. Alle unerwünschten Nebenwirkungen, abhängig von den Verunreinigungen, enthalten diese Medikamente kein Insulin.

Insulinpräparate werden je nach Beginn und Dauer der Wirkung in folgende Gruppen unterteilt:
1) schnelle und ultrakurze Insuline;
2) kurz wirkende Insuline ("einfache" Insuline);
3) Insuline mittlerer Dauer ("intermediäre" Insuline);
4) lang wirkende Insuline;
5) "gemischte" Insuline - eine Kombination von Insulinen unterschiedlicher Wirkdauer.

Die Anzahl der Insulinpräparate mit unterschiedlichen Namen beträgt mehrere Dutzend. Jährlich kommen neue Insulinnamen aus verschiedenen ausländischen und in den letzten Jahren inländischen Pharmaunternehmen hinzu.

Schnelle und ultrakurze Insuline

Die schnellen und ultrakurzen Insuline enthalten derzeit drei neue Wirkstoffe - Lispro (Humalog), Aspart (Novoid, Novolog) und Glulissin (Apidra). Ihre Besonderheit liegt im schnelleren Anfang und Ende der Handlung im Vergleich zu dem üblichen "einfachen" Insulin. Der rasche Beginn der Glukose-senkenden Wirkung neuer Insuline beruht auf ihrer beschleunigten Aufnahme durch subkutanes Fett. Die Besonderheiten der neuen Insuline ermöglichen es, die Zeit zwischen Injektionen und Nahrungsaufnahme zu verkürzen, das Niveau der nach der Nahrungsaufnahme auftretenden Glykämie und das Auftreten von Hypoglykämie zu reduzieren.

Der Wirkungseintritt von Lispro, Aspart und Glulissin tritt im Bereich von 5 bis 10-15 Minuten auf, die maximale Wirkung (Höhepunkt der Wirkung) liegt nach 60 Minuten, die Wirkungsdauer beträgt 3 bis 5 Stunden. Diese Insuline werden 5 bis 15 Minuten vor oder direkt vor einer Mahlzeit verabreicht. Es wurde festgestellt, dass die Verabreichung von Insulin lispro unmittelbar nach einer Mahlzeit auch eine gute glykämische Kontrolle bietet. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die Verabreichung dieser Insuline 20 bis 30 Minuten vor einer Mahlzeit zu Hypoglykämie führen kann.

Patienten, die auf die Einführung dieser Insuline umsteigen, müssen die Blutzuckerwerte häufiger kontrollieren, bis sie lernen, die Menge der verbrauchten Kohlenhydrate und die Insulindosis zu korrelieren. Somit werden die Dosen von Medikamenten jeweils individuell eingestellt.

Wenn nur Humalog (Insulin lispro), ein neuer Rapid oder ein Novize (Insulin aspart) oder Apidra (Insulin Glulisin) verwendet werden, können sie 4-6-mal täglich und in Kombination mit langwirksamen Insulinen dreimal täglich verabreicht werden. In Ausnahmefällen ist eine überschüssige Einzeldosis von 40 E zulässig. Diese Insuline, die in Fläschchen erhältlich sind, können in derselben Spritze mit Humaninsulinpräparaten mit längerer Wirkdauer gemischt werden. Bei diesem Hochgeschwindigkeitsinsulin wird zuerst in der Spritze gesammelt. Die Injektion ist unmittelbar nach dem Mischen wünschenswert. Diese Insuline, die in Patronen (Spezialhülsen) hergestellt werden, sind nicht für die Herstellung von Mischungen mit anderem Insulin bestimmt.

Es ist wichtig!
Neue Hochgeschwindigkeitsinsuline eignen sich für Patienten, die einen aktiven Lebensstil führen. Ihre Verwendung wird bei akuten Infektionen, emotionalem Stress, Erhöhung der Kohlenhydratmenge in Lebensmitteln, Einnahme von Medikamenten, die Hyperglykämie (Schilddrüsenhormone, Corticosteroide - Prednisolon usw.) fördern, und anderen Unverträglichkeiten empfohlen Insulinpräparate oder Hyperglykämie nach der Ernährung, die für die Wirkung anderer Insuline schlecht geeignet ist. Es sollte noch einmal betont werden, dass schnell wirkende Insuline in direktem Zusammenhang mit der Nahrungsaufnahme verwendet werden sollten.